[发明专利]一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，本发明涉及一种利用基因工程技术培育吴屯杨抗逆新品种的方法，本发明取材方便，直接用吴屯杨叶片作为外植体，对影响基因转化的因素，即抗生素敏感性进行了优化，建立了吴屯杨高效遗传转化系统。为吴屯杨抗逆新品种的培育提供一种转化效率更高的方法，可缩短培育吴屯杨抗逆新品种的时间，为林木的遗传改良提供了一个新途径。

主权项

一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法，具体步骤为：a.将吴屯杨无菌苗的叶片沿垂直主脉切2～4个切口，切口深达主脉，正面向上，放入预培养培养基中，光照培养2～3天，培养温度为25～27℃，光照强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18小时/天；所述的预培养培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；b.挑取农杆菌AGL0的菌落接种到含有卡那霉素50mg/L的10～15ml YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取10～100μl的菌液转接至30～50ml的YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养至菌体OD600达到0.8～1.0时，于4℃，12000rpm条件下离心5min得到菌体，用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮菌体，获得侵染菌液；c.将步骤a获得的叶片浸入步骤b获得的侵染菌液中，于26℃下、100rpm条件下，震荡10分钟，进行侵染；d.步骤c获得的叶片，除去叶片上的多余菌液，转移到共培养培养基上，暗培养2～3天，培养温度为25～27℃；所述共培养培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 200μmol/L蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；e.步骤d获得的叶片，除去叶片上的多余液体，转移到初次筛选培养基上，培养21天后，换到二次筛选培养基上，培养至分化出不定芽，所述的初次及二次筛选培养温度为25～27℃，光照强度为3000～4000Lux，光照时间为16～18小时/天；所述的初次筛选培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L+0.8～1.0mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；所述的二次筛选培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+Cef400mg/L+1.2～1.6mg/L PPT+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；f.待抗性芽伸长至2～5cm，将抗性芽接入生根培养基中，每瓶接种3株，培养2周；所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.03mg/L+NAA 0.03mg/L+Cef 400mg/L+PPT 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；g.采用CTAB法提取转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR法对候选植株进行鉴定，所用引物如下，上游引物：5’‑CGGTCTGCACCATCGTCAACC‑3’，下游引物：5’‑GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC‑3’；PCR反应条件：94℃1min，68℃1min，72℃2min，35个循环，72℃下延伸10min。