[发明专利]快速检测瓠瓜品种种子纯度方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了快速检测瓠瓜品种种子纯度方法及其试剂盒，属于作物生物技术领域。方法包括：(一)瓠瓜基因组DNA的部分测序和SSR引物开发设计；(二)SSR引物多态性信息含量PIC计算和诊断性SSR引物组合筛选；(三)瓠瓜5个主栽品种标准DNA指纹图谱的制备；(四)待测瓠瓜样品的检测等步骤工艺。该方法应用自主设计的8对诊断性SSR引物，增强了鉴别近似品种的能力，提高了检测的效率，由传统田间表现型鉴定的50-60天缩短为4-5小时，降低了检测费用，约为传统方法的六分之一，并提高了鉴定的准确性。本发明可在育种和种子企业中推广应用。

主权项

1.快速检测瓠瓜品种种子纯度的方法，其特征在于按以下步骤进行：(一)瓠瓜基因组DNA的部分测序和SSR引物开发设计：1)以主栽瓠瓜品种“杭州长瓜”为材料，应用测序仪对其基因组DNA进行1/4通量的一次测序，获得150,253条测序序列；2)运行Newbler序列拼接程序，对所得序列进行序列拼接以去除重复，获得无冗余的DNA序列86,561条；3)运行Mreps 2.5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，同时设计出跨越SSR位点的PCR引物；交由上海桑尼生物技术公司合成100对SSR引物；(二)SSR引物多态性信息含量PIC计算和诊断性SSR引物组合筛选：1)提取44个当前生产上主要的瓠瓜品种DNA，用合成的100对引物分别PCR扩增这些材料的DNA，PCR反应体积为12.5微升，退火温度为52℃；2)统计每对引物的扩增情况，对扩增条带进行0或1赋值，计算各引物的多态性信息含量即PIC；3)从扩增条带的稳定性、多态性条带的易分辨程度和引物多态性PIC指数三个方面进行综合评价，选取LSR011，LSR015，LSR040，LSR045，LSR047，LSR056，LSR063，LSR077共8对引物作为诊断性引物组合，具体是：(三)瓠瓜5个主栽品种标准DNA指纹图谱的制备：用表格所列8对诊断性SSR引物分别扩增‘浙蒲2号’、‘浙蒲6号’、‘安吉长瓜’、‘萧山地蒲’及‘杭州长瓜’5个主栽品种标准样的DNA后，将扩增产物在丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝29∶1的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染照相并记录结果，经Photoshop软件处理后获得主栽品种标准指纹图谱；(四)待测瓠瓜样品的检测：如待测样品要求鉴别目标品种为步骤(三)5个主栽品种之一的，则仅需将该待测样品进行基因组DNA提取、并用上述表格所列8对SSR引物进行同步骤(二)(1)的PCR反应、凝胶电泳、银染、取得指纹图谱后，与5个主栽品种标准指纹图谱进行比对，以确定待测样品的真伪并进而计算其纯度；如要求鉴别目标品种为非上述5个主栽品种，则需将待测样品与要求鉴别目标品种的标准样品，分别制备出指纹图谱并进行比对，以确定待测样品种子的真伪并进而按以下公式计算其种子纯度：种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％。