[发明专利]人甲状旁腺激素1-34的制备方法

摘要

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建人甲状旁腺激素1-34重组工程菌，进而发酵、纯化制备人甲状旁腺激素(1-34)的方法。本发明将编码人甲状旁腺激素的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建完成能高表达人甲状旁腺激素的基因工程菌；采用在发酵过程中添加IPTG和曲拉通X-100的化学渗透发酵技术，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外，有利于其继续合成、避免胞内蛋白酶的攻击，从而促进蛋白高产量胞外积累；同时，针对硫氧还融合蛋白的热稳定性，在发酵到达终点时，对发酵液进行热处理，这样离心后，可以直接从发酵液上清夜中回收得到初步纯化的目标蛋白。

主权项

人甲状旁腺激素的制备方法，包括以下步骤：①设计并合成PTH1‑34的基因序列，具体序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT；②将合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，装载于同样酶切的载体pET32a上，用DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌，得到大肠杆菌转化子，抽提该大肠杆菌转化子的质粒，然后构建完成表达载体pET32a‑PTH；③将上述表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌；④对该基因工程菌进行发酵，发酵过程中加入IPTG和曲拉通X‑100；⑤利用融合蛋白耐高温的特性，将发酵液加热处理，然后离心除去杂蛋白，初步纯化并浓缩目的蛋白；⑥将浓缩后的目的蛋白加入缓冲液，过层析柱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以进一步浓缩，除去杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；⑦在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶切高纯度的融合蛋白，使得融合标签和人甲状旁腺激素1‑34断裂。