[发明专利]通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法

摘要

本发明涉及一种通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，是以含有小麦45SrDNA基因序列的克隆pTA71和水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列的克隆pOs48，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用地高辛-dUTP标记的pOs48和用生物素-dUTP标记的pTA71，形成45SrDNA和Os48探针，用于对杂草稻的籼粳性鉴别，具体步骤是：将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片、变性，与含有探针的变性杂交液进行双色荧光原位杂交，在避光条件下对其信号进行检测，根据杂草稻有丝分裂前中期染色体上45SrDNA和Os48位点数目和分布特点，对不同来源的杂草稻进行籼粳分类。

主权项

通过两个DNA重复序列鉴别杂草稻籼粳性的方法，其特征在于：以含有小麦45S rDNA基因序列的克隆pTA71和水稻AA组染色体亚端粒串联重复序列的克隆pOs48，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用地高辛‑dUTP标记的pOs48和用生物素‑dUTP标记的pTA71，形成45S rDNA和Os48探针，用于对杂草稻的籼粳性鉴别，具体步骤是：a) 将被鉴定的杂草稻有丝分裂前中期染色体制片，在染色体制片上加150 ul 70% formamide/2×SSC，用22×40mm盖玻片盖片，置于90℃热台上变性3‑4min后，揭去盖玻片，迅速将载玻片置于‑20℃的70％酒精中洗涤5min，然后在90％、100％酒精中分别洗涤5min，取出载玻片，在空气中干燥；b) 配制含有探针的杂交液，在含有探针的22 ul杂交液中：10 ul去离子甲酰胺，2 ul 20×SSC，2 ul浓度为10 mg/ml 的ssDNA，2ul pOs48探针，2ul pTA71探针，4 ul浓度为50％的硫酸葡聚糖；将配制好的杂交液置于100℃水浴中变性，变性后杂交液置于冰上；c) 在每张经过变性的染色体制片上，加上22 ul含有pOs48和pTA71探针标记的变性杂交液，盖上盖玻片，置于保湿盒内，在37℃恒温箱中，8‑10h，进行双色荧光原位杂交，获得杂交后的染色体制片；d) 揭去盖玻片，用1×PBS对杂交后的染色体制片洗涤三次，在避光条件下对其信号进行检测；e) 根据重复序列Os48和45S rDNA在杂草稻有丝分裂前中期染色体上杂交信号的数目和分布特点，来鉴别其籼、粳性，其中：45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的1对，Os48位点数目为显示红色杂交信号的2‑3对，在有45S rDNA位点的染色体上无Os48杂交信号，为粳型；45S rDNA位点数目为显示绿色杂交信号的2对，Os48位点数目为显示红色杂交信号6‑7对，在有45S rDNA位点的染色体上均有Os48杂交信号，为籼型。