[发明专利]萨能羊早期胚胎性别鉴定方法

摘要

本发明提供一种萨能羊早期胚胎性别鉴定的方法，属于胚胎工程技术领域。本发明的萨能羊早期胚胎性别鉴定的方法，用HOT-Start PCR方法对萨能奶山羊早期胚胎性别进行鉴定，具体步骤包括：胚胎的获取、胚胎的质量鉴定、胚胎的显微取样、DNA提取、设计引物，利用PCR方法扩增，及电泳检测鉴定。本发明的方法具有实用性强、操作方便、准确性高的优点，且也能为其他家畜提供见解。

主权项

1.一种萨能羊早期胚胎性别鉴定的方法，其特征在于该方法用HOT-Start PCR方法对萨能羊早期胚胎性别进行鉴定，具体步骤如下：a.用手术法对供体羊进行冲胚，获取胚胎；b.取6～7d的A、B级桑椹胚和早期囊胚，进行冷冻或直接在实验室对其进行显微取样鉴定；c.用吸取法对b.步骤得到的桑椹胚和早期囊胚进行显微取样，对胚胎取不同的细胞数，将取样细胞放入PCR反应管中，准备进行DNA的提取及鉴定；取样后的胚胎进行发育潜能培养实验；d.PCR引物设计及模板DNA的制备：根据GeneBank收录的绵羊的基因序列，依据绵羊Y染色体特异重复序列(Z30265)设计两对引物，同时根据绵羊的编码肌形成蛋白(myogenin)基因(DQ453548)设计两套对照引物，其引物序列为：绵羊SRY基因和myogenin基因的引物序列然后将c步骤取出的取样细胞放入装有10μl超纯水的PCR反应管中，用反复冻融法对取样细胞进行DNA提取，将装有胚胎细胞的PCR反应管投入液氮中5min，而后在100℃的水中煮沸5min，这个过程重复2-3次，然后将提取的DNA放入超低温冰箱保存备用或直接进行鉴定；e.PCR扩增体系的建立PCR基本反应程序：94℃预变性3min，60℃退火30s，72℃延伸30s，35cycle结束后72℃延伸5min，反应结束后放入4℃冰箱保存或直接以2％的agarose凝胶电泳检测，采用25μL的PCR反应体系，其中包括10×buffer(Mg²⁺plus)，Taq酶，6×loading buffer，dNTP；f.PCR扩增产物的电泳检测 取1μl的6×loading buffer+5μl的PCR扩增产物加入已经做好的2％的agarose凝胶样孔中，100V电压电泳30min，溴化乙锭染色10min，凝胶成像系统中检测结果：如显示一条302bp的SRY条带，则为雄性，如无显示一条302bp的SRY条带，则为雌性。