[发明专利]副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法与用途

摘要

本发明是一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：先扩增目的基因tdh：再将目的基因片段tdh克隆至载体pET-28，构建表达载体pET-28-TDH，pET-28-TDH质粒转入表达菌株BL21；培养，诱导表达后，得克隆表达产物；对克隆表达产物斑点印迹反应检测，得到副溶血性弧菌类毒素；将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。本发明方法制得的副溶血性弧菌类毒素疫苗可用于受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类的免疫药物的用途，其免疫保护率可达50%左右。

主权项

一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：其步骤如下：（1）扩增目的基因tdh：引物1：5’‑GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA‑3’，引物2：5’‑GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC‑3’，    在引物1、2的5’端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点；以副溶血性弧菌基因组DNA为模板，扩增副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh；反应体系为50 µl，引物各200 nmol／L，dNTP各50 µmol／L，模板50 ng，95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30秒、53 ℃ 40秒、72 ℃ 50秒循环35 次，72℃终止延伸10分钟，产物割胶回收，得到目的基因片段tdh；（2）克隆表达：将目的基因片段tdh克隆至载体pET‑28，构建表达载体pET‑28‑TDH，pET‑28‑TDH质粒转入表达菌株BL21；接种于LB培养液中，37℃、180r/min过夜，次日将该菌液以2％比例接种于5ml LB培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，取1ml菌液，OD600为0.5‑0.7测吸光度，并收集菌体作为诱导表达前的对照菌体，其余菌液中加0.1mol／L的IPTG至终浓度为1mmol／L，20℃、200r/min诱导10小时后，5000r/min、5min收集菌体；用100µl重蒸水悬浮菌体，加等体积2×蛋白上样缓冲液，沸水浴10分钟，进行10％SDS‑PAGE电泳分析；以没有克隆tdh的pET‑28空质粒及未经诱导表达的质粒作为阴性对照；诱导表达后，离心收集沉淀，超声波破壁，按非变性条件抽提纯化蛋白过程进行纯化，聚乙二醇8000浓缩后，测其OD260、OD280，计算蛋白含量；得克隆表达产物；（3）斑点印迹反应检测：取10µl 克隆表达产物滴加在醋酸纤维膜上，50℃烘干10 分钟，后用5％脱脂牛奶封闭1小时；TBS缓冲液洗3次后，晾干；用封闭液稀释第一抗体His‑tag，稀释倍数为1：5000，37℃下脱色摇床上缓慢摇动1小时；用TBS洗膜三次，每次5 分钟；封闭液稀释第二抗体碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗体IgG，稀释比例为1：20000，37 ℃下脱色摇床上缓慢摇动1 小时；TBS洗膜一次；AP底物缓冲液洗膜二次；在10 mL AP底物缓冲液中加入BCIP 33 µl、NBT 66µl，显色至斑点清楚，确认克隆表达产物为TDH蛋白；该TDH蛋白即为副溶血性弧菌毒素；将TDH蛋白经0.3%甲醛脱毒处理，得到副溶血性弧菌类毒素；（4）疫苗制备：将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。