[发明专利]一种以酶为标靶的色谱筛选方法

摘要

本发明公开了一种以酶为标靶的色谱筛选方法，所述方法是以低酶活的酶用溶胶凝胶法制备成固定化酶整体毛细管色谱柱，再以固定化酶整体毛细管色谱柱筛选与所述固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物，所述低酶活的酶为一级结构完整、酶活降低到原酶活的1～3％的酶。本发明所研制的筛选方法对作为标靶的酶生物活性要求低，适宜于基因工程克隆酶的有效应用。可解决现有技术标靶酶需从病人的病变组织中提取得到的问题。

主权项

一种以酶为标靶的色谱筛选方法，所述方法是以低酶活的酶用溶胶凝胶法制备成固定化酶整体毛细管色谱柱，再以固定化酶整体毛细管色谱柱筛选与所述固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物，所述方法包括以下步骤：(1)将四乙氧基硅烷与乙腈以体积比1∶2混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，滴加入丙三醇，所述丙三醇与四乙氧基硅烷的物质的量之比为0.5∶1，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏，得到改性硅烷，所述改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1.0mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；(2)在浓度0.2mol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和低酶活的酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为200mg/mL，酶的浓度为90～150mg/mL，再加入体积为含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液体积的0.6％的3‑氨丙基三乙氧基硅烷，所得溶液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器将所述的混合液注入预处理过的毛细管中，注满后静置3～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入0.2mol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3～7℃下静置7～9天，制得固定化酶整体毛细管色谱柱；(3)将与酶无亲和作用的苯酚样品通入含有待验亲和关系作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱柱，控制流速4μL/m，可得到突破体积V0；所述突破体积是流出曲线纵坐标达到最大值的一半时所消耗的样品液体积；将待筛选化合物用标准液配置浓度小于0.1mol/L的四种不同浓度的样品溶液，所述标准液的配比为：0.05mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液，0.1mol/L氯化四甲基铵；将四种样品溶液分别用注射泵注入含有待验亲和关系作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱柱中，控制流速4μL/m，得到四种不同浓度样品溶液的突破体积V1～V4；若四种浓度各自的突破体积V1～V4相同，且小于V0，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶无亲和作用；若V1～V4有差异，且都大于V0，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用；其特征在于，所述低酶活的酶为一级结构完整、酶活降低到原酶活的1～3％的酶，所述原酶活为9000～12000活力单位/克。