[发明专利]一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法

摘要

本发明提供一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，每种基因型采用双探针检测，包括一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区，该方法以排除PCR扩增产物污染为前提、以双基因探针识别同一基因型为基础、以高灵敏度PCR-质谱联用为平台的高精确度检测和/或鉴定人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型的方法。

主权项

一种检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，所述HPV基因型，包括HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82和89型，每种基因型采用双探针检测，包括一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区，所述方法包括以下步骤：(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区域中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14‑28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；(2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；(3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；(4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs或类似核酸末端终止剂加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少20Da；(5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；(6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因的类型。