[发明专利]脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法

摘要

本发明公开的了一种脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，采用脱氢表雄酮和琥珀酸酐作为原料，利用混合酸酐法，分别制备脱氢表雄酮人工抗原(DHEA-BSA和DHEA-OVA)、抗脱氢表雄酮(DHEA)单克隆抗体，进而制备酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。通过与高效液相色谱(HPLC)法的比较，其操作步骤简单、可一次检测多个样本、且不需贵重仪器、同时在检测灵敏度、所需时间等方面均优于HPLC法。同时，相较于HPLC法ELISA方法无需使用正己烷、乙腈、甲醇等有机试剂，可减少对实验者及环境的毒害，在环保方面更胜一筹。

主权项

一种脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，采用脱氢表雄酮和琥珀酸酐作为原料，其特征在于包括以下步骤：步骤一、制备脱氢表雄酮人工抗原(DHEA‑BSA)，采用混合酸酐法制备DHEA‑BSA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取适量修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量BSA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到抗原DHEA‑BSA；步骤二、制备脱氢表雄酮人工包被抗原(DHEA‑OVA)，采用混合酸酐法制备DHEA‑OVA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量OVA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到人工抗原DHEA‑OVA；步骤三、制备抗脱氢表雄酮(DHEA)单克隆抗体，融合形成表达anti‑DHEA的杂交瘤细胞株；经多次有限稀释后由ELISA检测筛选P/N值最高的单克隆抗体；将细胞扩大培养后收取表达上清，选用蛋白A柱进行分离、纯化，浓缩后得到抗DHEA单克隆抗体；步骤四、制备酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，使用固相载体，包被步骤二所得的DHEA‑OVA经过封闭、洗板处理后制成酶标板，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，再经生物素‑亲和素放大系统，依次加入底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。