[发明专利]一种丙酸杆菌属菌株质粒纯化的方法

摘要

本发明公开了一种针对于丙酸杆菌属菌株质粒纯化的方法，通过对菌体前处理以及后续处理，能够从丙酸杆菌属菌株中得到高纯度的质粒，与常规方法相比大大提高了质粒的浓度和纯度。本发明对于丙酸杆菌属的分子操作方面的研究打下了坚实的基础，并且对于其他革兰氏阳性菌(如乳酸菌属)可能具有普遍的适用意义。

主权项

一种丙酸杆菌属菌株质粒提取的改良方法，其特征在于主要包括如下步骤：(1)取一定体积的培养菌液，4℃、10000g离心3min，去上清，得菌体沉淀；(2)用步骤(1)中菌液体积1/30‑1/10的SET洗脱液洗涤，于4℃、10000g条件下离心3min，去上清，沉淀干燥得湿重，快速冻融一次；所述SET洗脱液含0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris‑Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)；(3)加入步骤(1)中菌液体积1/30‑1/10的溶液I彻底悬浮；所述溶液I含50mmol/L葡萄糖，20g/mL Rnase A，25mmol/L Tris‑Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)；(4)加入1/10溶菌酶溶液和1/10变溶菌素溶液，37℃水浴30min；所述溶菌酶溶液为200mg/mL溶菌酶溶于Tris‑Cl(pH7.4)，变溶菌素溶液为1000U/mL溶于Tris‑Cl(pH7.4)；(5)加入步骤(1)中菌液1‑3体积的蛋白酶K溶液，56℃水浴30min，期间每个8‑10min混匀一次；所述蛋白酶K溶液为50mg/mL蛋白酶K溶于Tris‑Cl(pH7.5)；(6)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/5的新配制的溶液II，轻轻颠倒5‑6次；所述溶液II为0.2N NaOH，1％(m/V)SDS；(7)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/10的冰预冷的碱裂解液III，反复颠倒数次，然后置于冰上3‑5min，于4℃、10000g条件下离心5min，将上清转移至另一离心管中；所述碱裂解液III为5mol/L乙酸钠60mL，冰乙酸11.5mL，H2O 28.5mL；(8)加入与步骤7制的的液体等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V)，剧烈振荡，于4℃、10000g条件下离心2min，转移上层水相到另一离心管中；(9)加入步骤(1)中菌液体积1/20‑1/5的异丙醇剧烈振荡，室温放置2min，于室温10000g条件下离心5min，吸除上清；(10)加1mL 70％乙醇，颠倒数次，于室温10000g条件下离心2min，除去上清；(11)用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀，温和震荡数次，贮存于‑20℃；所述TE为100mmol/L Tris‑Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。