[发明专利]柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种柑桔衰退病毒的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)检测方法。应用环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，根据GenBank公布的柑桔衰退病毒(CTV)不同株系的基因序列，针对病毒序列保守区域设计了CTV的RT-LAMP检测方法的特异性引物4条，其序列为，F3：CGAAGTGGATTTGTCTGACA；B3：GGAATCCCTGCATCTAGCG；FIP：ACTCGAAGGGCGTTAGTACGGCTTTGGACTGACGTCGTGTT；BIP：CTGGGGTAGGACTAACGATGCCGACGTCCGCCATAACTCAA。4条引物分别完全与识别的靶序列中6个区序列匹配。实验结果表明：灵敏度比普通逆转录-聚合酶链锁反应(RT-PCR)高100倍，对病毒早期诊断准确性更高。本发明与RT-PCR方法检测结果一致，比DTBIA方法灵敏、准确。本发明方法可快速、准确、灵敏地检测柑桔衰退病毒，适合样品快速检测、CTV流行监控、脱毒苗木鉴定和衰退病毒的鉴别。

主权项

1.一种柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于：根据CTV的保守序列设计RT-LAMP检测的特异性引物2对：一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，4条引物序列如下所示；利用特异性引物，在63～65℃条件下恒温反应45～60分钟，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样品中是否含有柑桔衰退病毒；利用该方法建立的试剂盒，包含有LAMP反应液和LAMP特异引物的混合液构成的检测体系；CTV保守序列以及根据该序列设计的引物F3、B3、FIP、BIP如下所示：F3 5-CGAAGTGGATTTGTCTGACA-3B3 5-GGAATCCCTGCATCTAGCG-3FIP 5-ACTCGAAGGGCGTTAGTACGGCTTTGGACTGACGTCGTGTT-3BIP 5-CTGGGGTAGGACTAACGATGCCGACGTCCGCCATAACTCAA-3其中，所述检测试剂盒包括以下溶液：溶液1：(5×反应液)成分：Tris-HCL(PH8.8)100mM，KCL 50mM，MgSO₄40mM，(NH₄)₂SO₄50mM，Tween200.5％，Betain 4M，dNTPs 7mM each，AMV反转录酶10U/μl，BstDNA置换酶40U/μl；溶液2：(5×引物混合液)成分：F3 1uM，B3 1uM，FIP 4uM，BIP 4uM；溶液3：超纯水。