[发明专利]高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

摘要

高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，涉及一种高效分泌表达AcAPc2的CHO细胞株。本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产的问题。高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAPc2的细胞株。本发明的CHO细胞株可以高效表达AcAPc2，表达量最高达到10mg/L·72h，且可以工业化生产。用于抗凝血，治疗肿瘤、败血症等。

主权项

1.高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAPc2的细胞株，具体方法按以下步骤进行：一、目的片段双酶切：由上海生工公司合成带有信号肽的AcAPc2基因序列克隆到T载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下：酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；二、质粒载体双酶切：用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系如下：酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；三、DNA片段的连接，反应体系如下：连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAPc2；四、细胞培养：用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-；五、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAPc2与质粒pDCH1P 11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95％融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1∶10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；六、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。