[发明专利]蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法

摘要

本发明属于一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法，方法包括蚕蛹预处理，人生长激素类似脂蛋白的初步分离，用4号蛋白吸收峰的所得品进行亲和层析纯化和超滤浓缩等步骤。本发明能利用蚕蛹作为原料，通过分离纯化获得具有降低血液粘稠度，改善血液微循环的天然药用蛋白，该方法操作简便，且产量高，适用于大规模生产，提纯的天然蛋白可作为保健药物，无毒副作用。

主权项

一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法，其特征在于：包括下步骤，(1)蚕蛹预处理，将新鲜蚕蛹与预冷的PBS液，温度1～5℃，pH值为7.4，按重量比1∶1加入到榨汁机中匀浆30sec，在冰上冰浴4～8min，继续匀浆，重复三次，使蚕蛹中的蛋白充分溶解，将所得品转移到离心杯中4℃，12000rpm离心20min，取上清液通过九层纱布过滤除去大颗粒不溶杂质，将滤液再次离心过滤，重复三次，收集过滤后的滤液4℃，60％硫酸铵沉淀蛋白，去除油脂，8000rpm离心30min，弃上清，用预冷的PBS液重悬沉淀，0.45μm滤膜真空抽滤，得预处理上清液，4℃保存；(2)人生长激素类似脂蛋白的初步分离，选择AKTA explorer10中的Size Exclusion对预处理上清液进行分离并脱去色素，流动相为PBS液，pH值为7.4，压力0.5Mpa，流速1.5ml/min；程序结束后，共出现6个蛋白吸收峰，根据目的出峰时间判断第5和第6号蛋白吸收峰为17kDa以下的色素及小分子物质，人生长激素类似脂蛋白，分子量30kDa，应出现在第4号峰，因此收集前面4个蛋白吸收峰，并进行SDS‑PAGE电泳和Western Blot检测，结果表明人生长激素类似脂蛋白存与第4号蛋白峰中，用4号蛋白吸收峰的所得品进行后续纯化；(3)亲和层析纯化，用4号蛋白吸收峰的所得品进行亲和层析纯化，亲和层析柱的制备取2mL 50％的Plus coupling Resin装入柱壳中，平衡至室温，放出残余液体，加入3倍柱体积Coupling Buffer，0.1M Sodium phosphate，0.15M NaCl，pH值为7.2，平衡柱子，之后加入2mL hGH标准品1mg/ml和40μL Cyanoborohy dride，室温下摇床孵育4h或4℃保持7～9h，在通风橱里打开盖子，收集放出的液体，用BCA蛋白定量，计算偶联效率；再加入5倍柱体积Quenching Buffer，1M Tris‑HCl，pH值为7.4，0.05％NaN3，洗填料，之后加入2mL Quenching Buffer和40μL Cyanoborohy dride，室温下摇床孵育30min；在通风橱打开盖子放出反应的气体和溶液，加入5倍体积Wash Solution，1M NaCl，0.05％NaN3洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4℃保存；亲和纯化人生长激素类似脂蛋白，室温平衡柱子，之后打开盖子弃去保护液，用5倍柱体积的Binding Buffer，0.15M PBS，pH值为7.4，再次平衡柱子；所得品经过0.45μm滤膜过滤后上柱，室温摇床孵育1h，放出溶液，用Wash Buffer，0.15M PBS，pH7.4，洗去未结合样品，最后加入Elution Buffer(0.1MGlycine‑HCl，pH值为2.5，洗脱结合在柱子上的蛋白，用Neutralization Buffer，0.5M Tris‑HCl，pH值为8.5，调pH值至中性；收集样品，BCA蛋白定量后进行SDS‑PAGE电泳检测；(4)超滤浓缩，使用中空纤维膜进行超滤，选择合适的中空纤维膜规格，截留分子量为3kDa，进行清洗后加样，用适量无菌PBS，pH值为7.4，超滤浓缩，无菌分装，‑50℃冷冻干燥，制成冻干粉，得本发明的成品。