[发明专利]一种慢病毒感染细胞的检测方法

摘要

本发明公开了一种慢病毒感染细胞的检测方法，包括合成单链随机寡核苷酸文库，以MOI=5感染HEK293细胞；将随机寡核苷酸文库与靶分子一起孵育，于4℃摇动培养1小时后以PBS洗涤单细胞层；酶解收获细胞，重悬细胞于0.5mlH2O、95℃x5min以释放被结合的寡核苷酸配基候选分子，经PCR或者RT-PCR生成新的次一级文库，再与该靶分子结合进行第二轮的筛选，如此反复若干循环，即可筛选出能与该靶分子特异性结合的核酸配基，将核酸配基用Cy5标记，并与慢病毒感染了的HEK293细胞一起孵育，洗涤后作流式细胞分析，经鉴定的核酸配基克隆至载体上测序分析。本发明能快速、简便、有效地检测被慢病毒感染了的人体组织细胞，也能用于其它病毒感染或者其它疾病发生过程的检测。

主权项

一种慢病毒感染细胞的检测方法，其步骤为：1）人工合成单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度为20～40碱基，文库容量在10E＾14～10E＾15之间；2）以MOI=5感染HEK293细胞，室温摇动孵育1小时以助细胞均匀地吸收病毒，在37℃、5%CO2培养箱孵育12小时后吸弃细胞上培养基开始特异性配基筛选；3）将随机寡核苷酸文库与位于慢病毒感染了的HEK293细胞表面的靶分子一起孵育, 于4 ℃以120 rpm摇动培养1小时以助配基—配体充分结合； 孵育结束后以PBS洗涤单细胞层；酶解收获细胞，重悬细胞于0.5mlH2O、95℃x5min以释放被结合的寡核苷酸配基候选分子；释放出的寡核苷酸配基候选分子，经PCR或者RT‑PCR生成新的次一级文库，再与该靶分子结合进行第二轮的筛选，如此反复若干循环，即可筛选出能与该靶分子特异性结合的核酸配基；4）将核酸配基用Cy5标记，并与慢病毒感染了的HEK293细胞一起孵育，洗涤后作流式细胞分析，以评估所筛选、富集核酸配基的活性；非标记的核酸配基竞争实验以提高核酸配基的亲和性及特异性；经鉴定的核酸配基随后克隆至载体上测序分析。