[发明专利]小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，具体步骤：①获取混合细胞。②单个核细胞的获取：胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1∶1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACSbuffer美天旎分选缓冲液，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞。所述MACS??buffer是含有2mM摩尔/毫升的EDTA和0.5％的FCS胎牛血清的PBS盐离子缓冲液。③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取。本发明有益的效果是：方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的肠道上皮黏膜固有层树突状细胞，所得细胞在体外条件下保持了良好的抗原递呈能力，为体外模拟体内抗原递呈细胞诱导淋巴细胞分化提供了良好条件。

主权项

一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，其特征在于：具体步骤：①获取混合细胞：取出生4 6周的C57BL/6小鼠过度麻醉后，剪开小鼠，取出小肠；将小肠置于37°预热的分离上皮细胞的缓冲液HBSS Buffer中，去除脂肪、结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；小肠剪碎后转移至50毫升离心管中加入30毫升37℃预热的HBSSBuffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的HBSS Buffer，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37℃预热的RPMI清洗缓冲液，37℃水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37℃预热的collagenase/DNase Solution胶原酶/DNA酶混合液，37℃水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤，滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟；②单个核细胞的获取：胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1∶1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1 2毫升MACS buffer美天旎分选缓冲液，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞；所述MACS buffer是含有2mM摩尔/毫升的EDTA和0.5％的FCS胎牛血清的PBS盐离子缓冲液；③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取：Ficoll密度梯度离心得到的细胞用MACSbuffer重选，按照美天旎磁珠分选CD11c的说明分选树突状细胞。