[发明专利]可直接观察HBVcccDNA在肝组织中分布定位的试剂盒

摘要

本发明涉及一种原位检测乙肝病毒cccDNA的方法和试剂盒。将肝组织样本切片固定，进行消化，然后进行原位滚环加跨缺口PCR扩增，最后检测扩增产物。本方法可直接观察到HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位，且操作比较简便，不需要将肝组织制成匀浆，不需抽提出核酸做模板，判定结果也不需要制做标准曲线。

主权项

一种可直接观察HBVcccDNA在肝组织中的分布及定位的检测试剂盒，检测对象是肝组织切片；所述试剂盒含有去污剂、dNTP和1×PBS、组织切片固定剂、脱蜡试剂、封闭试剂、无水乙醇、蛋白酶、PSAD酶、Phi29 DNA聚合酶、滚环引物、Phi29 buffer、1×TBS、NBT/BCIP和碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体；其特征是：(1)还含有如下引物序列：P59： 5‑GGCCACCTCTCTTTA‑3P83： 5‑DIGCGGCACAGCTTGGAGG‑3；(2)还含有核固红；(3)所述封闭试剂是BSA；(4)所述滚环引物有8个，序列为如下所示：(5)还含有盐酸；所述组织切片固定剂的组成是：85％无水乙醇、10％甲醛和5％冰醋酸；所述蛋白酶是蛋白酶K，所述脱蜡试剂是二甲苯，所述去污剂是TritonX‑100；所述盐酸的浓度是0.2mmol/L，所述TritonX‑100的浓度是0.1％，所述BSA的浓度是3％，所述核固红的浓度是0.1％；检测方法步骤为：将患者肝组织样本固定，消化，然后进行PCR扩增，最后检测扩增产物；1)所述样本固定是将肝组织样本经10％甲醛固定，石蜡包埋，连续切片；2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶进行消化；3)所述PCR扩增是在肝组织切片上进行原位滚环加跨缺口PCR扩增；4)扩增产物的检测是在滚环加跨缺口PCR扩增后的肝组织切片上滴加碱磷酶标记的抗地高辛抗体，孵育一定时间后，滴加NBT/BCIP；室温普通显微镜下肉眼直接观察肝组织切片显色情况，细胞核出现蓝色、紫色及紫蓝色颗粒者为HBVcccDNA表达阳性，细胞核出现红色者为HBVcccDNA表达阴性；5)整个检测过程均在载有肝组织切片的玻璃载玻片上进行。