[发明专利]海地瓜消化道总RNA快速提取方法

摘要

本发明涉及海地瓜消化道总RNA快速提取方法。目前海底花消化道总RNA提取前样品处理比较困难，总RNA提取得率不高且容易受污染。本发明方法将采用液氮冷冻海地瓜消化道组织，采用研钵研磨后置入TRIZOL裂解液中裂解、匀浆；组织匀浆离心后取上清，加入氯仿并震荡混匀，离心取上清；加入低温异丙醇，混匀、离心沉淀；75%乙醇洗涤；无RNA酶的去离子水溶解沉淀物，-90～-70℃保存。本发明方法有效避免了样品RNA降解，提高了RNA沉淀效果，该方法提取时间短，RNA完整性好，完全可以满足实时定量PCR检测要求。

主权项

海地瓜消化道总RNA快速提取方法，其特征在于该方法的具体步骤是：步骤(1).解剖取海地瓜消化道，使用针头纵向剖开消化道管，采用经膜过滤及高温灭菌的海水清洗后用液氮冷冻；步骤(2).将冷冻后的海地瓜消化道研磨成粉末，取30～50mg粉末加入到液氮预冷的离心管中；步骤(3).离心管中加入0.8～1.2ml的TRIZOL裂解液，振荡混匀，常温下静置5～10min，离心0.5～2min；步骤(4).取上清液，加入200～300 l氯仿，振荡混匀5～10min，静置5～10min后离心10～20min ，取上层水相200～300 l；步骤(5).取出的上层水相中加入与上层水相等体积的经过 30～ 10℃预冷的异丙醇，混匀后 30～ 10℃下静置10～20min，离心5～15min，沉淀RNA；步骤(6).将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1～2ml经 30～ 10℃预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；步骤(7).吹洗沉淀后，重复步骤(6)；步骤(8).去除上清后离心1～2min，移液枪吸除剩余液体，加入20～40 l的无RNA酶去离子水，混匀后在3～5℃下放置10～20min，溶解RNA；步骤(9).获得的RNA溶液中加入4～5 l的无RNA酶的DNA酶缓冲液、8～10 l浓度为1U/ l的无RNA酶的DNA酶及1～2 l的RNA酶抑制剂，混匀后30～40℃恒温培育30～60min，成培养液；步骤(10).培养液中加入与培养液等体积的经过 30～ 10℃预冷的异丙醇，混匀后 30～ 10℃下静置10～20min，离心5～15min，再次沉淀RNA；步骤(11).再次将离心管置于冰盒中，去除上清后加入1～2ml经 30～ 10℃预冷的浓度为75%乙醇进行清洗；步骤(12).吹洗沉淀后，重复步骤(11)；步骤(13).去除上清后离心1～2min，移液枪吸除剩余液体，加入20～40 l的无RNA酶去离子水，混匀后在3～5℃下放置20～40min，再次溶解RNA；步骤(14).取1～3 lRNA溶液用于凝胶检测和浓度检测，其余置于 90～ 70℃保存。