[发明专利]在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法

摘要

一种在竞争性抑制剂保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于用黄嘌呤或氧嗪酸等竞争性抑制剂，在碱性硼酸盐或磷酸盐缓冲液中用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶，可用但不限于用聚乙二醇单甲醚的丁二酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚的碳酸活泼酯、聚乙二醇单甲醚甲磺酸酯、聚乙二醇单甲醚醛；所用竞争性抑制剂浓度要达到其抑制常数1倍以上，所用活化聚乙二醇要达到待修饰尿酸酶中氨基摩尔总量的6倍以上才有明显保护作用；在竞争性抑制剂保护下聚乙二醇修饰后保留的尿酸酶活性可显著提高。

主权项

1.一种在竞争性抑制剂结合保护下用针对氨基的活化聚乙二醇修饰尿酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行：(一)、将活化可修饰氨基的聚乙二醇衍生物简称为活化聚乙二醇，包括N‑羟基琥珀酰亚胺或对硝基苯酚或三氯苯酚活化聚乙二醇羧酸酯、N‑羟基琥珀酰亚胺或三氯苯酚或对硝基苯酚活化聚乙二醇碳酸酯；(二)、将浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.5～9.5间的硼酸钠缓冲液或浓度在0.01～0.20mol/L且pH在7.0～8.5间磷酸钠缓冲液，在2度到25度之间恒温5到120分钟；当所用缓冲液体积很大时，搅拌缓冲液以快速达到所需温度；缓冲液的温度如下设定：如用聚乙二醇羧酸酯的活化形式修饰氨基则缓冲液pH控制在8.0到9.2间且温度不高于25度，如用聚乙二醇碳酸酯的活化形式修饰氨基则缓冲液pH控制在7.5到9.0间且温度控制在不高于20度；(三)、选择黄嘌呤、氧嗪酸钾、8‑氮杂黄嘌呤这三种尿酸酶竞争性抑制剂中的一种，溶解在步骤(二)恒温的缓冲液中达到其对拟修饰尿酸酶抑制常数的2倍以上或达到饱和；尿酸酶竞争性抑制剂称为对尿酸酶进行聚乙二醇修饰的保护剂；将保护剂的缓冲液在相同温度下恒温；(四)、将纯化的原核或真核尿酸酶，称取适量加入到步骤(三)所得含保护剂缓冲液中，温和搅拌5分钟到20分钟，获得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其浓度在0.5g/L以上而在100g/L以下保证全部溶解，将尿酸酶溶液在相同温度下恒温；(五)、按所用纯化尿酸酶的质量、亚基分子量及其每个亚基中所含来自赖氨酸残基的氨基和N端氨基数量计算单位质量尿酸酶中氨基的摩尔量；按活化聚乙二醇平均分子量和质量，计算活化聚乙二醇摩尔量；称取适量活化聚乙二醇固体，使其摩尔量达到来自步骤(四)所用尿酸酶的氨基总摩尔量的6倍以上；(六)、将活化聚乙二醇固体，直接以每批10mg的量，用药匙分批加入到步骤(四)所得尿酸酶溶液中，边加边温和搅拌；(七)、在步骤(二)设定的温度下，温和搅拌或震荡反应10分钟到30小时；将所得溶液对浓度为10～50mmol/L的相同pH缓冲液透析除去竞争性抑制剂得到聚乙二醇修饰的尿酸酶溶液，或进一步超滤浓缩后冷冻干燥得到粉末状修饰产物。