[发明专利]嵌合外源无关序列的核酸质控的制备方法

摘要

本发明公开了一种嵌合外源无关序列的核酸质控的制备方法，通过在无关序列的两侧，采用基因克隆法或化学合成法添加微生物特异性引物序列，然后利用PCR扩增，将扩增产物与pGEM-T载体连接，获得DNA质控，进一步利用体外转录技术即可获得可以作为分子检测试剂盒的RNA质控。本发明制备的核酸质控均含有一段和检测对象无关的基因序列，在后续的阳性排查中，可以鉴别是否是由于操作污染造成的虚假扩增。在阴性对照正常的条件下，核酸质控样品的阳性扩增，指征检测反应的有效和正确。

主权项

嵌合外源无关序列的核酸质控的制备方法，包括如下步骤：（1）无关序列来源及选择：包括方法Ⅰ或方法Ⅱ，当检测反应为基于产物长度时选用方法Ⅰ，当检测反应为taqman 实时定量PCR或类似中间含探针的检测反应时选用方法Ⅱ；所述方法Ⅰ：从现有的质粒载体上选取一段DNA序列，用生物学软件分析该DNA序列的GC含量和二级构象，满足如下条件的DNA序列选用为无关序列Ⅰ：a）无关序列Ⅰ与待检测微生物的同源性低于5%，b）GC含量在45%～55%之间，c）二级结构较为简单，d）平均TM值在60℃～85℃之间；所述方法Ⅱ：采用化学法合成一段无关序列Ⅱ，满足无关序列Ⅱ和待检测微生物无同源性；（2）引物的设计利用引物设计的一般原理针对步骤（1）方法Ⅰ中所述无关序列Ⅰ和待检测微生物分别设计一对无关序列Ⅰ引物和一对待检测微生物特异性引物Ⅰ，在无关序列Ⅰ引物的上游和无关序列Ⅰ引物的下游的5′端分别加入待检测微生物特异性引物Ⅰ上游和待检测微生物特异性引物Ⅰ下游，得到一对嵌合引物；用引物设计的一般原则针对待检测微生物设计一对待检测微生物特异性引物Ⅱ和待检测微生物探针，还需要针对无关序列Ⅱ设计一对无关序列Ⅱ引物；化学合成一段从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物Ⅱ、无关序列Ⅱ、待检测微生物探针、无关序列Ⅱ、待检测微生物下游引物Ⅱ的DNA片段；（3）PCR扩增用步骤（2）中所述嵌合引物，PCR扩增步骤（1）方法Ⅰ所述现有的质粒载体，获得双链DNA序列产物Ⅰ：产物Ⅰ从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物Ⅰ、无关序列Ⅰ上游引物、无关序列Ⅰ、无关序列Ⅰ下游引物和待检测微生物下游引物Ⅰ；用步骤（2）中所述待检测微生物特异性引物ⅡPCR扩增步骤（2）所述DNA片段，获得双链DNA序列产物Ⅱ：从5′端到3′端依次是待检测微生物上游引物序列Ⅱ、无关序列Ⅱ上游引物、无关序列Ⅱ、待检测微生物探针、无关序列Ⅱ、无关序列Ⅱ下游引物、待检测微生物下游引物Ⅱ；（4）克隆琼脂糖电泳PCR产物，使用胶回收试剂盒回收产物Ⅰ或产物Ⅱ，在分光光度计法定量后，TA连接产物Ⅰ或产物Ⅱ到pGEM‑T载体上，通过抗性筛选，PCR鉴定转化子，获得阳性转化子pGEM‑T‑产物Ⅰ或pGEM‑T‑产物Ⅱ，即所需的DNA质控Ⅰ或DNA质控Ⅱ；将DNA质控Ⅰ或DNA质控Ⅱ转化并保存于大肠杆菌工程菌中；（5）体外转录和纯化将pGEM‑T‑产物Ⅰ或pGEM‑T‑产物Ⅱ经过单酶切进行线性化，酶切位点位于插入基因外，利用体外转录试剂盒进行体外RNA的合成，获得RNA质控Ⅰ或RNA质控Ⅱ；纯化步骤为：a）补充无RNAse酶灭菌水至100μL，然后加入900 μL TriPure Isolation Reagent，振荡混匀，室温静置5 min，加入 200 μL 氯仿，震荡60 s，然后于4℃，12000 r/min高速离心15 min；2）取500 μL上清液，并加入等体积异丙醇室温静置30 min, 12000 r/min高速离心15 min，弃去上清，用75%乙醇洗涤1次；3）然后加入1 mL 75%乙醇，保存于‑80℃冰箱或液氮。