[发明专利]一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法

摘要

本发明公开了一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤：A、稳定表达sIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建：a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化：设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得sIFITM3基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染：构建表达sIFITM3的猪成纤维细胞；c、转染sIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖；B、手工核移植方法获取重组囊胚：a、受体细胞的准备；b、去核以及核供体细胞的注射；C、胚胎移植以及转基因猪的获取：a、胚胎移植：将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，检测；b、转基因个体鉴定。方法易行，操作简便，该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。

主权项

一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤是：A、稳定表达sIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建：a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化：设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT‑PCR扩增获得sIFITM3基因，大小438bp，通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA中，获得载体pCA‑sIFITM3，大小为5151bp，通过SspI和XhoI双酶切pCA‑sIFITM3和pCDNA3.1(+)(Invitrogen，neo+/Amp+，5.4kb，分别回收2280bp的外源片段和4324bp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACAsIITM3，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染：为了构建稳定表达sIFITM3的猪成纤维细胞，按照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5％CO2，38.5℃培养；c、转染sIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖：转染sIFITM3基因后，将核供体细胞培养2‑4天，利用600μg/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过PCR和RT‑PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达sIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；B、手工核移植方法获取重组囊胚：a、受体细胞的准备：制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38.5℃的洗卵液2％v/v血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均匀的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40‑50个为一个孔，移至在5％CO2培养箱平衡6小时，内置400μL卵母细胞体外培养液：TCM‑199(1X)80％v/v，hCG 15IU/mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0.10mg/mL，庆大霉素0.05mg/mL，猪卵泡液10％，血清10％的四孔板中，38.5℃，5％CO2成熟36小时，用于克隆操作；b、去核以及核供体细胞的注射：用5.0μg/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，将成熟后的卵母细胞‑卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，进行显微操作，将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20～25μm的尖的去核管吸取少量1μL细胞质，吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，产生核移植胚胎；C、胚胎移植以及转基因猪的获取：a、胚胎移植：进行胚胎移植，将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植88个融合细胞，共移植5头母猪，胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测6次；b、转基因个体鉴定：小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，通过PCR对sIFITM3进行基因组进行鉴定。