[发明专利]制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法

摘要

本发明公布了一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法，其特征在于：通过构建含有靶基因的慢病毒载体来进行转基因鱼的生产，其含有GFP报告基因可用于检测转基因的效果。本发明能够生产慢病毒转基因鱼，转基因鱼的成活率12.2%。

主权项

1.制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现：（1）、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF402958，设计引物：IGF2b-BamHI-F：GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCAIGF2b-NheI-R：CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；扩增其CDS区ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGGTCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGTGGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGTTTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGTGTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGACGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACATGTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCCCCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCACCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，用Trizol抽提鲤鱼中的RNA，反转录成cDNA；PCR扩增条件优化：以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下：ComponentFinal Con.Volume (μL)10× Buffer1×5MgSO₄(50 mM)2.5 mM2dNTP (10 mM)0.2 mM1IGF2b-BamHI-F (10 μM)0.5 μM1IGF2b-NheI-R (10 μM)0.5 μM1Template 1Taq HIFI (5 U/μL, Invitrogen)1 U0.2ddH₂O To 50 ul循环条件：回收PCR产物，后克隆测序验证，而后进行慢病毒载体包装，同样会的包装后的慢病毒载体同样要进行IGF2b基因克隆测序验证；（2）在（1）的基础上，通过荧光显微镜观察法进行慢病毒滴度测定，在感染293T细胞后观察GFP表达状况以及IGF2b基因mRNA的表达情况；（3）在（2）基础上，通过人工授精的方式获得鲤鱼的未分裂的受精卵;通过显微注射的方法进行转基因鲤鱼的生产。