[发明专利]一种多色标记活体病毒颗粒的方法

摘要

本发明公开了一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其步骤：A、借助病毒展示系统，将绿色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白GP64融合表达，构建出GP64上带有绿色荧光蛋白的重组病毒；B、金属配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+溶液加入胎牛血清的Grace’s培养基中培养sf宿主细胞；将构建的重组病毒Bac-EGFP加入培养的宿主细胞中进行病毒感染，置于培养箱中培养，收获子代病毒；C、收集，纯化双色标记的子代病毒颗粒，得到的子代病毒通过透射电镜，电感耦合等离子体质谱和激光扫描共聚焦显微镜表征其结构，测量其单颗病毒金属配合物含量及展示其单颗病毒的双荧光信号。操作简便，标记效率高，得到的标记病毒具有优异的荧光信号，能更好地满足实时示踪活病毒颗粒侵染宿主细胞研究的需要。

主权项

1.一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其步骤如下：(1)借助病毒展示系统，将绿色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白GP64融合表达，构建出GP64上带有绿色荧光蛋白的重组病毒；根据GenBank中AcMNPV基因组序列用引物设计软件Primer premier 5，设计EGFP/gp64基因表达引物，在gp64的5’和3’分别加入EcoR I和HindIII两个酶切位点，首先，以提纯的pEGFP-N1质粒作为模版，FEG1和REG-G为引物进行PCR扩增；将得到的PCR产物EGP0作为模板，以FN2和REG-G为引物再次进行PCR扩增，得到一段包含GP64信号肽和EGFP序列的片段，命名为EGP1，然后以提纯的Bacmid DNA为模板，FG-EG和RG为引物进行PCR扩增，得到一段包含有gp64肽段序列的片段，命名为EGP2，EGP1的3’端加入的27个EGP2的5’端序列由引物REG-G引入，EGP2的5’端加入的24个EGP1的3’端序列由引物FG-EG引入，这样EGP1和EGP2就有了24个互补碱基，OverlapPCR实验以EGP1和EGP2为模板，FN2和RG为引物，扩增出在gp64信号肽序列后面融合有EGFP序列的片段，命名为EGFP/gp64，PCR反应体系如下：将连接反应产物电转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中制备质粒EGFP/gp64-T Easy Vector，限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶切供体质粒EGFP/gp64-T Easy Vector和表达载体pFastBac1，酶切产物经凝胶电泳显示出大小不同的片段，在紫外灯下切取与EGFP/gp64片段和酶切后的pFastBac1片段大小相符合的胶带，回收DNA片段，纯化回收后在4℃进行连接反应，EGFP/gp64片段插入到表达载体pFastBac1相应的多克隆位点中；双酶切在37℃条件下进行3h，反应体系如下：连接反应体为4℃过夜反应，两片段的加入量根据两片段的浓度和大小对作调整，反应体系如下：连接产物电转化入制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的平板上进行蓝白斑筛选，提取白色菌落的质粒DNA，进行EcoR I-HindIII双酶切鉴定，命名为pFastBac1-EGFP，以50％甘油/菌液体积比3∶7存于-80℃冰箱中；将pFastBac1-EGFP转座入野生型杆状病毒全基因组Bacmid中，操作步骤如下：将冻存的DH10Bac感受态细胞从冰箱中取出，在冰浴中加入1μLpFastBac1-EGFP质粒DNA，两者轻轻混匀后转移到预冷的转化杯中，在电转化仪上转座，操作电压为1800V，电转化成功后快速向转化杯中加入0.8mL SOC培养基，混匀的混合物转移到EP管中37℃，200rpm摇床培养4h，取5μL菌液加入20mg/mL的X-gal 40μL和200mg/mL的IPTG 4uL，涂于含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的固体培养平板上，将平板倒置于37℃培养，16-24小时后进行蓝白斑筛选；用接种环挑取平板上的白色菌落，在100μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的平板上再次进行蓝白斑筛选，挑取平板上的白色菌落，分别接种于含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，沾取各管中菌液，用M13Forward和M13Reverse引物、以及M13Forward和RG引物或者FN2和M13Reverse引物对菌液进行PCR鉴定，命名为Bacmid-EGFP，以50％甘油/菌液体积比3∶7存于-80℃冰箱中；PCR体系为：鉴定为正确的克隆重新转接到含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中培养，16-24小时后提取整管菌液质粒，转染Spodopterafrugiperda细胞得第一代病毒，提取Bacmid-EGFP质粒的步骤为：将菌液倒入1.5mL的eppendorf管中，5,000rpm离心2min后倒掉上清，继续倒入试管中剩下的菌液，重复操作三次直至菌体完全沉淀；加入300μL溶液I振荡打散菌体沉淀；加入300μL溶液II，反复颠倒三到四次至混匀，静置至澄清；加入300μL提取Bacmid的溶液III，颠倒混匀，冰上放置5min；12,000rpm离心15min，吸取上清转到另一个1.5mL的eppendorf管中；加入800μL异丙醇，-20℃放置25min后12,000rpm离心15min；倒掉上清，加入70％体积比的乙醇1mL，12,000rpm离心5min；彻底去除上清，室温干燥，加入20μL ddH₂O溶解；sf9细胞传代到35mm小皿中，在含有10％质量体积比胎牛血清的Grace’s培养基中于28℃无CO₂条件下培养至贴壁，转染前用无血清Grace’s培养基洗两次，准备转染液：A溶液：16μLBacmid-EGFP质粒与84μL无血清Grace’s培养基混合均匀，B溶液：8μLlipofectamine与92μL无血清Grace’s培养基混合均匀，B溶液逐滴加入A溶液中产生脂类-DNA复合物，20-25℃静置45min，每隔5min用手弹匀，每支复合物加入800μL无血清Grace’s培养基，抽吸混匀，滴加入待转染的sf9细胞中，置于23℃无CO₂培养箱中培养6-7个小时，吸出转染混合物，加入2mL含有10％质量体积比胎牛血清的Grace’s培养基，置于23℃无CO₂培养箱中培养，6天后收集第一代重组病毒，命名为Bac-EGFP；(2)金属配合物[Ru(phen)₂(dppz)]²⁺溶液加入10％质量体积比胎牛血清的Grace’s培养基中培养sf宿主细胞；将步骤1所构建的重组病毒Bac-EGFP加入培养的宿主细胞中在25℃条件下进行病毒感染，增殖，操作为：sf9细胞在含有10％质量体积比胎牛血清的Grace’s培养基中生长至70％大皿底面积时用于扩增病毒，先吸出部分培养基，使余下的培养基刚好淹没细胞，加入500mL第一代重组病毒，置于23℃无CO₂培养箱中感染1.5h，每隔半个小时晃动一下，感染后的细胞加入6mL含有10％质量体积比胎牛血清的Grace’s培养基，置于23℃无CO₂培养箱中培养，4天后收获子代病毒；(3)收集，纯化双色标记的子代病毒颗粒，得到的子代病毒通过透射电镜，电感耦合等离子体质谱和激光扫描共聚焦显微镜表征其结构，测量其单颗病毒金属配合物含量及展示其单颗病毒的双荧光信号。