[发明专利]一种禽巴氏杆菌基因组疫苗的制备方法

摘要

一种禽巴氏杆菌基因组疫苗的制备方法，利用限制性内切酶Sau3AⅠ对目的基因进行酶切，利用限制性内切酶BamHI对真核表达载体pcDNA3.1(+)进行酶切，利用小牛小肠碱性磷酸酶对酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(+)进行去磷酸化，后将禽巴氏杆菌基因组和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行连接，转化入大肠杆菌感受态JM83中，提取质粒，酶切鉴定后获得禽巴氏杆菌基因组疫苗；本发明方法所制备出的禽巴氏杆菌基因组疫苗通过动物试验检测表明，可降低禽巴氏杆菌病的发生，降低禽巴氏杆菌对禽类侵袭，其制作方法简单，容易操作。

主权项

一种禽巴氏杆菌基因组疫苗的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：步骤一、禽巴氏杆菌的提取1）取0.1毫升的禽巴氏杆菌，将其接种到10毫升的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃条件下，培养18小时，形成菌液，备用；2）从步骤1）的菌液中提取禽巴氏杆菌基因组，将得到的禽巴氏杆菌基因组放置在‑20℃条件下，备用；步骤二、禽巴氏杆菌基因组的酶切、回收及纯化：1）酶切体系的配制：在0.5ml离心管a中加入42.5微升的禽巴氏杆菌基因组、2.5微升的限制性内切酶 Sau3AⅠ和5微升的10倍限制性内切酶Sau3AⅠ缓冲液，混合均匀，得到50微升的混合物A，将上述含有混合物A的0.5ml离心管a放在温度为37ºC的水浴锅中，放置4分钟，取出，再将含有混合物A的0.5ml离心管a放在温度为75℃的水浴锅中，放置30分钟，取出，冷却至21℃，备用；2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物A，在凝胶成像系统中确认混合物A中含有酶切后的禽巴氏杆菌基因组的目的基因；3）用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的禽巴氏杆菌基因组进行回收、纯化取1.5ml离心管a并称其重量，在紫外灯下将混合物A从步骤2）中的凝胶上切下，将切下的混合物A放在已称重的1.5ml离心管a中，称取1.5ml离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将1.5ml离心管a中的混合物A捣碎，加入与混合物A等体积的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管a放置在50ºC水浴中加热至混合物A完全融解，得到混合液Ⅰ，将混合液Ⅰ加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，将收集管a置于21℃条件下放置1分钟，后将收集管a放到离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，后将收集管a在21℃条件下放置1分钟，后将收集管a送入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，后将收集管a放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的液体后，将DNA纯化柱a置于收集管a内，再将收集管a放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a将其放置于1.5ml离心管b中，后在DNA纯化柱a上加入30微升洗脱液，将1.5ml离心管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到1.5ml离心管中b中的液体，该液体就是酶切并纯化后的禽巴氏杆菌基因组，存储于‑20℃条件下，备用；步骤三、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切、回收、纯化及去磷酸化：1）酶切体系的配制：在0.2毫升离心管a中加入50微升的真核表达载体pcDNA3.1(+)、10微升的限制性内切酶BamH I、10微升的10倍的限制性内切酶BamH I缓冲液和30微升的水，混合均匀，得到的混合物B，将上述混合物B放入37ºC的水浴锅中，反应7小时，备用；2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物B进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中确认混合物B中含有酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(+)；3）用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(+)进行回收、纯化取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将混合物B从步骤2）中的凝胶上切下，将切下的混合物B放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物B的重量，然后将1.5ml离心管c中的混合物B捣碎，加入等体积的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50ºC水浴中加热至混合物B完全融解，得到混合液Ⅱ，将混合液Ⅱ加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃条件下放置1分钟，将将收集管b放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱b，倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱b置于收集管b内，后将收集管b在21℃条件下放置1分钟，后将收集管b放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱b，倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱b置于收集管b内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱b，倒掉收集管b内的液体，将DNA纯化柱b置于收集管b内，然后将收集管b放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱b上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管b放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到1.5ml离心管中d中的液体，该液体就是酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)，备用；4）真核表达载体质粒pcDNA3.1(+)的去磷酸化取步骤3）中酶切并回收后的真核表达载体质粒pcDNA3.1(+)40微升并加到0.5毫升离心管b中，然后再在0.5毫升离心管b中加入5微升的10倍小牛小肠碱性磷酸酶缓冲液、2微升的小牛小肠碱性磷酸酶和3微升的水，混合均匀，得到混合物C，将含有混合物C的0.5毫升离心管b放在37℃的水浴锅中，放置30分钟，然后在0.5毫升离心管b中加入100微升的无水乙醇，混合均匀，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心10分钟，离心后倒掉0.5毫升离心管b内沉淀物上层的液体，再向0.5毫升离心管b中加入15微升的三羟甲基氨基甲烷‑乙二胺四乙酸溶液，混合均匀，得到去磷酸化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)，存储于‑20℃条件下，备用；步骤四、禽巴氏杆菌基因组疫苗的制备1）禽巴氏杆菌基因组与真核表达载体pcDNA3.1(+)的连接：在1.5ml离心管e中依次加入6微升纯化后的禽巴氏杆菌基因组、10微升的真核表达载体pcDNA3.1(+)、2微升的T4 DNA连接酶和2微升的10倍T4DNA连接酶缓冲液，混合均匀，得到的混合物D，将上述含有混合物D的1.5ml离心管e放入16℃的水浴锅中，反应12小时，待反应结束后，取出备用；2）将大肠杆菌JM83菌株放置在0ºC的冰水混合物中，放置8分钟，备用；3）取步骤2）中100微升的大肠杆菌JM83，将其加到含有混合物D的1.5ml离心管e中，混合均匀，得到混合物E，将含有混合物E的1.5ml离心管e置于0ºC的冰水混合物中，放置5分钟，取120微升的混合物E加到0ºC的电击杯内，将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1.8千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0.05秒，电击结束后，取出含有混合物E的电击杯，然后在电击杯内加入1毫升的SOC培养基，混合均匀，得到混合物F，将电击杯内的混合物F转移到1.5ml离心管f中，将1.5ml离心管f置于37ºC的摇床中，转速225转/分钟，振荡培养为1小时，待培养结束后，取出，取100微升培养后的混合物F，并涂布于含有浓度为60微克/毫升的氨苄青霉素的LB固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37ºC的培养箱内，倒置培养16小时，备用；4）挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入30毫升含氨苄青霉素的LB液体培养基中，氨苄青霉素的浓度为60微克/毫升，后将含有氨苄青霉素的LB液体培养基置于37ºC恒温摇床内，转速为200转/分钟，振荡培养15小时，形成培养液，备用；5）取1.0毫升的培养液，将其加到1.5ml离心管g中，将1.5ml离心管g放入4℃离心机内离心，转速13000转/分钟，离心1分钟，弃去1.5ml离心管g中沉淀物上层的液体，在1.5ml离心管g中加入100微升4ºC的溶液Ⅰ，均匀混合后，加入200微升的溶液Ⅱ，混合均匀，将1.5ml离心管g在21℃条件下放置4分钟，然后向1.5ml离心管g中加入150微升4ºC的溶液Ⅲ，混合均匀，后将1.5ml离心管g放于0ºC的冰水混合物中，静置10分钟，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4ºC的条件下离心10分钟，取出，备用；6）取1.5ml离心管g中的上层澄清液体400微升，将其加到1.5ml离心管h中，然后依次向1.5ml离心管h中加入200微升的苯酚和200微升的氯仿，振荡混匀后，得到混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5ml离心管h放入冷冻离心机内，在转速为13000转/分钟，4ºC条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400微升将其转移到1.5ml离心管i中，后向1.5ml离心管i中加入400微升氯仿，振荡混匀后，得到混合液Ⅳ，将含有混合液Ⅳ的1.5ml离心管i放入冷冻离心机内，在转速为13000转/分钟，4ºC条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400微升将其转移到1.5ml离心管j中，再向1.5ml离心管j中加入1毫升的无水乙醇，将1.5ml离心管j置于21ºC条件下，放置30分钟，后取出放入离心机内，转速13000 转/分钟，4ºC条件下离心20分钟，弃去1.5ml离心管j中沉淀物上层的液体，得到下部沉淀物Ⅰ，备用；7）向含有沉淀物Ⅰ的1.5ml离心管j中加入500微升浓度70%的乙醇，混合均匀，转速为13000转/分钟，离心1分钟，倒掉1.5毫升离心管j中沉淀物上层的液体，得到沉淀物Ⅱ，待1.5毫升离心管j中的沉淀物Ⅱ干燥后，向含有沉淀物Ⅱ的1.5毫升离心管j中加入20微升的PBS溶液，浓度为0.01 mmol/L，pH值为7.2，进行溶解，得到混合液Ⅴ，备用；8）在1.5毫升离心管k中加入3微升混合液Ⅴ、1微升的限制性内切酶EcoRⅠ、1微升的10倍限制性内切酶EcoRⅠ缓冲液和6微升的水，混合均匀，将1.5毫升离心管k放置于37℃水浴锅内，放置2小时，形成混合液Ⅵ，即得到禽巴氏杆菌基组疫苗，备用；9）利用琼脂糖凝胶电泳对混合液Ⅵ进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合液Ⅵ，电泳结束后在凝胶成像系统中观察到6000bp的条带时，证明禽巴氏杆菌基组疫苗制备成功；所述的载体为真核表达载体pcDNA3.1(+)；所述的LB培养固体培养基的组成成份：按重量百分比LB培养固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉，余量为水；所述的LB液体培养基的组成成份：按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述胰蛋白胨大豆肉汤培养基的组成成份：按重量百分比胰蛋白胨大豆肉汤培养基中含有1.5%的胰蛋白胨，0.5%的大豆蛋白胨，0.5%的氯化钠，余量为水；所述SOC培养基组成成份：按重量百分比SOC培养基中含有2%的胰化蛋白胨、0.5%的酵母提取物、0.05%的氯化钠、0.02%浓度为2.5mmol/L的氯化钾、0.1%浓度为10 mmol/L的氯化镁、0.36%浓度为20mmol/L的葡萄糖，余量为水；所述PBS溶液组成成份：按重量百分比PBS溶液中含有0.8%的氯化钠、0.024%的磷酸二氢钾、0.02%的氯化钾、0.144%的磷酸氢二钠，余量为水；所述三羟甲基氨基甲烷‑乙二胺四乙酸溶液的组成成份：每升三羟甲基氨基甲烷‑乙二胺四乙酸溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述电泳缓冲液的组成成份：每升电泳缓冲液中含有40mmol的Tris碱、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的洗脱液的组成成份：按重量百分比洗脱液中含有40%的浓度10mol/L的乙酸钠、8.5%的冰醋酸，余量为水；所述的溶液Ⅰ的组成成份：每升溶液Ⅰ中含有50 mmol的葡萄糖、25 mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、10 mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的溶液Ⅱ的组成成份：按重量百分比溶液Ⅱ中含有0.06%浓度为10mmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的溶液Ⅲ的组成成份：按重量百分比溶液Ⅲ中含有60%的浓度5 mol/L的乙酸钾、11.5%的冰醋酸，余量为水。