[发明专利]一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法

摘要

一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明涉及枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解一种成本低廉的末水条斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用SephadexG-10、DEAE-52和SOURCE3RPC等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定DPPH消除能力，清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。经RP-HPLC分析型色谱测定其纯度，Q-TOF-MS分析鉴定其氨基酸组成，并对其抗氧化活性的稳定性进行研究。该紫菜抗氧化活性肽具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基，可作为食源性抗氧化剂，在保健食品，医药和化妆品领域有广泛的应用前景。

主权项

一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的分离纯化、鉴定方法，其特征在于：（1）以烘干到恒重的末水条斑紫菜粉末为底物，以pH8.5 Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的质量比例为1:30，中性蛋白酶加入量为E/S=1×105‑2×105U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1×104 ‑2×104U/g，50℃水解6 h，80℃灭酶15min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%，室温静置12h，10000 r/min离心10min，得到的上清液为含紫菜抗氧化多肽粗品；（2）将紫菜抗氧化多肽粗品通过大孔树脂D101脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末，将该淡黄色多肽粉末依次经过Sephadex G‑10、DEAE‑52和SOURCE 3RPC ST4.6/100进一步分离纯化后，得到紫菜抗氧化活性肽；a）Sephadex G‑10凝胶层析：脱色后的多肽粉末进行凝胶层析，流动相为0.1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/min，收集峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末；b）DEAE‑52离子交换层析：步骤a)所得多肽粉末进行离子交换层析，采用阶段洗脱的方法，流动相：0~250 min 0.1 mol/L NaCl，250~400 min 0.2 mol/L NaCl，400~550min 0.3 mol/L NaCl 和550~650min 0.4 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液，进样量为20 mL，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，收集峰组分，冷冻干燥；c）SOURCE 3RPC ST4.6/100反相层析：步骤b)所得多肽粉末进行反相层析，流动相为A：含0.1%三氟乙酸的10%‑15%乙腈溶液；B：含0.1%三氟乙酸的80%‑75%乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～20 min 100% A；20~40 min 100%A~100%B；40~60 min 100%B，进样量为2 mL，流速1.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集浓缩的峰组分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；当其浓度为100μg/mL时，对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率依次为超过20%，45%，45%，还原能力为VC的1倍以上，有很强的抗氧化性；（3）分析鉴定：将所得酶解紫菜抗氧化活性肽进行反相高效液相RP‑HPLC分析型色谱测定，其纯度达85%以上；超高效液相色谱—质谱法Q‑TOF‑MS分析鉴定为一种六肽DGVGYG：Asp‑Gly‑Val‑Gly‑Tyr‑Gly；（4）温度耐受性：将所得酶解紫菜抗氧化活性肽分别在60℃，80℃及100℃的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上。