[发明专利]小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法

摘要

本发明公开了一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法。其步骤包括细胞分离、培养和纯化三个阶段，特别是在分离过程不中断营养的供给，改进了三次换液时间和洗涤方法，以及使用差速消化法提高细胞纯度。本发明能够从小鼠的脂肪组织中分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，为后期对脂肪干细胞进一步的研究奠定了基础。

主权项

一种小鼠脂肪干细胞的分离、培养及纯化方法，包括以下步骤：一、细胞的分离(1)取材：取4周龄的ICR雄鼠，处死，对其全身消毒；(2)无菌条件下切取腹股沟处的脂肪组织，放入含青霉素和链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗净血污；(3)去除脂肪组织中的血管，再次洗涤，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，消化液的组成成分为10％胎牛血清(FBS)，0.09％胶原酶I，余量为DMEM/F12；用连接有1ml吸嘴的移液器充分吹打，直至组织能够很通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中；记录加入消化液的量和最终悬液的体积，以计算脂肪组织的量，并使最终消化液的体积是脂肪组织的2‑3倍；(4)37℃消化1h，定时摇动，使组织块与消化液充分接触；(5)消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；(6)1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打至少1min，再次离心；(7)弃掉上层成熟脂肪细胞和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；(8)将细胞悬液先用孔径为250μm的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μm的尼龙滤网过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上细胞的残留；(9)将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；二、细胞培养(10)最后一次离心后用完全培养基重悬，接种，置于培养箱常规条件培养；(11)每0.4‑0.6ml左右的脂肪组织分离得到的细胞接种到六孔板的一孔中；(12)首次换液：原代接种2h后加入弃去培养基，用DPBS反复洗涤5‑6次，洗去大部分杂细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；(13)第二次换液：首次换液24h后对其进行第二次洗涤，进一步洗去未贴壁细胞和组织块，加入新鲜的完全培养基继续培养；(14)第三次换液：首次换液后72h后进行第三次洗涤，直至细胞面基本干净，加入新鲜的完全培养基继续培养；后期每3天半量换液一次，长至90％满即传代；三、纯化(15)细胞长满后，加入胰酶消化2min，迅速将已消化下来的细胞转移并终止，离心重悬后接入新皿中继续培养，前皿底残留的细胞则弃去；利用此方法多次传代，逐渐降低杂细胞的比例，从而达到纯化的目的。