[发明专利]一种评价微藻产油能力的方法

摘要

本发明公开了一种评价微藻产油能力的方法，该方法包括下述步骤；(1)微藻细胞收集及淬灭；(2)提取细胞内脂肪酸；(3)脂肪酸甲酯化；(4)GC-MS检测；(5)计算日产量；(6)十六烷值确定对微藻产油能力进行评价，本发明的方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。

主权项

一种评价微藻产油能力的方法，其特征是包括如下步骤：(1)微藻细胞收集及淬灭：取出已培养好的藻液样品3‑5份，每份100‑150mL，4℃下3000‑5000rpm，离心3‑4min，收集下层的细胞，用3‑5mL代谢终止液，在‑40℃下淬灭5‑10分钟，终止代谢反应，在‑80℃下冷冻干燥4‑6h获得冻干细胞；所述代谢终止液为含有1500mg·L‑1NaNO3，36mg·L‑1CaCl2·2H2O，75mg·L‑1MgSO4·7H2O和40mg·L‑1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；(2)提取细胞内脂肪酸：从3‑5份步骤(1)获得的冻干细胞中各取15‑25mg分别置于离心管中，每管加入0.75‑1.5mL氯仿及0.3‑0.6mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入2‑4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入2‑4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，向其中加入0.5‑1mL 1M KCl水溶液，震荡，3000‑4000rpm，离心3‑5min，弃水相，再加入1‑2mL超纯水，震荡，3000‑4000rpm，离心3‑5min，弃水相，30‑35℃真空干燥得干物质；所述脂肪提取液为质量百分比为0.1％的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为66.7％；(3)脂肪酸甲酯化：将步骤(2)获得的3‑5份干物质分别溶于3‑5份600‑1000μL质量百分比为14％的三氟化硼‑甲醇溶液中，加入10‑20μg十七烷酸做为内标，分别置于15mL密封管内，在100℃水浴20‑30min，温度降至室温，加入500‑1000μl正己烷震荡萃取30s，4000‑5000rpm离心2min，得到正己烷相；取100‑200μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；(4)GC‑MS检测采用GC‑MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下：色谱柱：DB‑5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；进样量：1μL；分流比：10∶1；进样口温度：280℃；GC interface温度：270℃；氦气流速：恒压，91KPa；升温程序：70℃保持2min，以8℃·min‑1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；电离电压：70eV；源温：250℃；扫描范围：50‑800m/z；扫描速度：2scan·s‑1；从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；(5)计算日产量根据如下公式，计算藻类脂肪酸甲酯混合物的日产量：P＝∑Wi/Day/CV其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤(1)所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤(1)所述收获时微藻培养液的体积；(6)十六烷值确定根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：SN＝∑(560×Pi)/MWi             aIN∑(254×D×Pi)/MWi            bCN＝46.3+5458/SN‑0.225×IN      c其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤(4)中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。