[发明专利]海胆变态相关的SSR标记筛选方法

摘要

本发明公开一种海胆变态相关的SSR标记筛选方法，是针对海胆幼虫及稚胆阶段个体小、DNA含量少的特点，采用固定液固定，用裂解液直接裂解法获得海胆发育早期每个个体的DNA，用以进行微卫星扩增的模板，所得带型清晰稳定，杂带少，可筛选出海胆变态前后出现频率差异的位点和等位基因，有助于揭示影响海胆变态的遗传学背景和分子机制。具体步骤如下：将若干个中间球海胆八碗幼虫用DMSO固定液固定后，用裂解液A裂解；对于壳径小于1.0cm的稚胆，用75%酒精固定，裂解液B裂解；所得的DNA裂解液作为模板分别进行SSR扩增；筛选得到与中间球海胆变态相关的一系列SSR标记。

主权项

一种海胆变态相关的SSR标记筛选方法，其特征在于按如下步骤进行：a．固定取若干海胆八腕幼虫，用DMSO固定液固定，固定液体积至少为幼虫体积的10倍，所述DMSO固定液的成分是15%DMSO、0.25mol/L EDTA及饱和NaCl；4℃冰箱中保存；取若干壳径<1.0cm的稚胆，将稚胆个体置于浓度为75%酒精中固定；4℃冰箱中保存；b. 裂解取经固定液固定的海胆八腕幼虫，经蒸馏水清洗后分离完整个体，再将每个个体分别置于0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液A，所述裂解液A的成分是10mmol/L pH8.0的Tris‑HCl、50mmol/L KC1、1%Tween‑20及0.7ug/ul蛋白酶K；取经酒精固定的稚胆个体，用蒸馏水反复冲洗，再将每个个体切口后分别置于其0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液B，所述裂解液B的成分是2.5mmol/L pH8.0的Tris‑ HCl、0.2mmol/L EDTA及0.7ug/ul蛋白酶K；将上述PCR管分别在55℃水浴恒温3h后，升温到85℃保持10min，冷却到室温后置于‑20℃冰箱中保存备用；c. 微卫星扩增将所得海胆八腕幼虫DNA裂解液和稚胆DNA裂解液分别作为微卫星扩增的模板进行扩增，每种模板扩增10 个SSR位点，位点名称分别是INTS01、INTS02、INTS04、INTS10、INTS12、INTS14、INTS19、INTS20、ST16和ST24；微卫星扩增体系是：取所得的DNA裂解液1ul，10×buffer 2.5ul，SSR上下游引物（10uM）各1.0ul，dNTP（10mM）2.2ul，Mg2+（25mM）1.5ul，Taq酶 （5U/ul）0.35ul，ddH2O 15.45ul作为PCR反应液；PCR反应程序为：94℃5分钟；94℃1分钟，退火温度1分钟，72℃40秒，30个循环；72℃10分钟，之后4℃保存；d. 变态相关位点筛选利用X2检验的方法，筛选海胆变态前后出现显著频率差异的微卫星位点和等位基因。