[发明专利]电激转化法选育高温型阿魏菇的方法

摘要

本发明涉及食用菌品种培育技术领域，是一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其包括第一步阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立、第二步外源基因的获得、第三步电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体、第四步筛选优良再生菌株、第五步转化子的鉴定。与现有技术相比，本发明获得了生长速度快、不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新种质，其出菇温度为温度白天25℃，夜间17℃，并且出菇时间提前了30天。在经济效益上，该发明有效地改良了阿魏菇的品质，不仅缩短了生长周期、节约了栽培成本，而且可以开展反季节生产，真正为种植农户增收添砖加瓦。

主权项

一种电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，阿魏菇原生质体制备及再生体系的建立：对选取的阿魏菇进行接种，进一步扩大培养菇种；采用酶解法制备原生质体，获得较纯的原生质体后，镜检，用血球计数板计数；其最佳制备原生质体的条件为：在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下，菌龄为8 天的阿魏菇菌丝体0.1 g在0.8 ml混合酶解液中制备原生质体，该混合酶解液为含1.5%离析酶、0.5%纤维素酶、2%溶菌酶的水溶液，35 ℃酶解3 h获得原生质体达5×106 个/ml，涂布于原生质体再生培养基上，其最佳条件为：在0.8 mol/L 蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16天，其再生率可达0.6%；第二步，外源基因的获得，提取平菇总DNA：称取平菇子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入适量液氮，研磨材料，然后加入1mlCTAB混合，该CTAB为含DTT50μL /ml的水溶液；倒入已加入100μL氯仿/辛醇的EP管中；晃动EP管，放入65℃水浴锅中30min，接着室温放置15min；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，轻轻混匀，13000rpm离心7min；取上清液放入干净EP管中，加入冰的无水乙醇；样品放在冰上或‑20℃，不要晃动，最后出现絮状沉淀；13000rpm离心7min；弃去上清液，75%酒精/0.2M NaAc 1mL洗涤沉淀2次，醇挥发后放入加无菌水和RNA酶，溶解，‑20℃保存备用；用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的纯度；用分光光度计对DNA 进行紫外扫描，测260nm、280nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水把DNA浓度稀释到1μg/μL；第三步，电激法将外源基因导入阿魏菇原生质体：用1mol/L的山梨醇将纯化的原生质体稀释至2×105个/ml置于42℃浮浴5min，再向低温处理过的2mL的电激杯加入300μL的原生质体溶液和20μL平菇DNA，采用ECM630电激系统，在1600V条件下电激，取出电激杯冰浴静止10分钟至15分钟，涂布于原生质体再生培养基上，25℃黑暗培养，2周后，将出现的菌落进行筛选实验；第四步，筛选优良再生菌株：将第三步获得的菌落、未电激的阿魏菇菌丝和平菇菌丝进行生长临界温度筛选实验；未电激的阿魏菇菌丝在32℃时菌丝停止生长甚至死亡，平菇在32℃时菌丝能正常生长，并且第三中的菌落同样能够生长，筛选出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；将能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株继续培养，测定生长速度，将生长速度明显高于受体菌株的再进行复筛；培养6天至7天，分别对单菌落进行镜检，有锁状联合特征的菌株视为一个转化子；第五步，转化子的鉴定：1）酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；2）纤维素酶活力测定采用3,5‑二硝基水杨酸法；3）RAPD分析；最终，确定含有外源平菇DNA插入的转化子，得到高温型阿魏菇菌株。