[发明专利]一种体外PXR激活特性筛查的方法

摘要

本发明涉及一种体外诱导剂的筛选方法，特别涉及体外PXR激活特性筛查的方法。该方法包括如下步骤：报告基因载体的构建；细胞培养和G418工作浓度的筛选；细胞瞬时转染；稳定转染细胞克隆的筛选；稳定转染细胞株被检药物(配基药物)诱导鉴定；对PXR激活特性进行筛选。当PXR被配基药物激活时，可以调控CYP3A基因表达。PXR基因缺失小鼠失去CYP3A的药物诱导性。相反，在转基因小鼠肝脏表达激活状态的hPXR受体可导致CYP3A酶的持续性高表达。本发明建立了基于此通路高通量筛选的关键技术并在药物研发早期即对化合物库中的海量化合物进行PXR激活特性筛查，可以减少新药上市后产生不良药物相互作用的风险，同时使研发费用大大降低。

主权项

1.一种体外PXR激活特性筛查的方法，该方法包括如下步骤：1)、报告基因载体的构建：设计引物，用引物对dis-F/dis-R和pro-F/pro-R分别扩增人CYP3A4启动子远端调控序列(-7833～-7208)和近端启动序列(-361～+11)，将远端调控序列和近端调控序列分别进行EcoR I-EcoR V和EcoR V-Hind III双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物进行连接，然后用引物对dis-F/pro-R进行远端调控序列和近端调控序列线性串联片段的克隆，连入pGLuc-Basic载体的EcoR I/Hind III位点，转化大肠杆菌，经酶切和测序验证，载体命名为pGLuc-NEB-3A4-1，即1号；用dis-F-Bgl II/dis-R-EcoR I引物对扩增远端片段，将其连入1号载体的Bgl II/EcoR I位点，转化大肠杆菌，经酶切和测序验证，载体命名为pGLuc-dou-dis-3A4-9，即9号；所述载体引物为载体引物构建表2)、细胞培养和G418工作浓度的筛选：常规培养HepG2细胞于6孔板中，5％CO₂、37℃，培养基为MEM+10％FBS+1％NEAA，至细胞密度达50％布满时，加入含G418的培养液1ml/孔，G418终浓度为900μg/ml，换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养3周；3)、细胞瞬时转染：HepG2细胞用MEM+10％FBS+1％NEAA进行培养；转染前24h，按20×10⁴细胞/孔的量接种至24孔培养板中；转染时将500ng hPXR表达载体，300ng1号或9号，与2.5μL LipofectamineTM LTX转染试剂孵育后加入至1个培养孔，转染7h后更换为MEM+10％FBS培养基，培养12h后，更换为含有1μL DMSO和10μM RIF处理培养基，继续培养，在加入RIF后24、48小时点上检测荧光素酶活性；转染和检测共重复3次，每次转染均设置复孔；4)、稳定转染细胞克隆：筛选采用G418压力选择和有限稀释法克隆化，将9号和PXR表达载体共转染HepG2细胞，瞬转细胞用胰酶消化，做细胞计数，按每孔200个细胞转移至96孔板，按终浓度900μg/ml加入含G418的MEM全培养基，培养3周后，获得稳定生长的细胞克隆，将其依次转移至24孔板、6孔板和培养瓶扩大培养；稳定转染的细胞株用含500μg/ml G418的MEM全培养基维持培养；5)、稳定转染细胞株被检药物(配基药物)诱导鉴定：加药前24小时，按10×10细胞/孔的量接种稳定转染细胞株至96孔培养板中，每孔加入被检药物，使被检药物终浓度为10μM；在加入被检药物后于24h、48h吸取细胞培养液上清，进行荧光测定；6)、数据的统计分析使用SAS 9.2软件，对PXR激活特性进行筛选。