[发明专利]一种鸭AvBD2基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗

摘要

一种鸭AvBD2基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗其特征在于鸭AvBD2基因真核表达质粒由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段构成，由该质粒制成的分子佐剂是将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成1mg/ml即可，疫苗是将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成1mg/ml，然后与禽DNA疫苗混合即可。本发明与已有技术相比，具有鸭β-防御素-2（AvBD2）所特有的免疫增强作用的、适合在禽类DNA疫苗中使用的优点。

主权项

一种鸭AvBD2基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段构成，该鸭AvBD2基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设计过程；2、鸭AvBD2基因片段的PCR获取过程；3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD‑2的构建过程；4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD‑2的制备过程；（1）上游引物、下游引物的设计过程：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸭AvBD2基因序列经多重比较后设计而成，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去除了前导肽序列处开始，并加上Hind III酶切位点及2个保护性碱基CG；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点及2个保护性碱基CC，所设计的引物序列为：上游引物：5’‑cgAAGCTTAAACCATGCGGGACATGTTTCTCTGT‑3’  Hind III ，下游引物：5’‑CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG‑3’    BamHI酶切位点 ，（2）鸭AvBD2基因的PCR扩增过程：以重组质粒pMD‑18T‑AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR buffer，2μL 的4×dNTPs，浓度为20μmol/L 的0.5μL的上游引物，浓度为20μmol/L的 0.5μL的下游引物，1μL 的pMD‑18T‑AvBD2质粒，40.5μL 的ddH2O，浓度为5umol/L 的0.5μL 的ExTaq DNA聚合酶，10×PCR buffer 包含有0.5mmol/L MgCl2、50mmol/L KCl、10mmol/L Tris·HCl、0.001wt%明胶，4×dNTPs包含有浓度均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP和 dGTP，反应过程是：a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理30s，再在56℃处理30s，再在72℃处理30s；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，所获得的鸭AvBD2基因片段核苷酸序列为：atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTGGAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA；PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到约120bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；（3）鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2的构建过程：将过程2的鸭AvBD2基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有10mmol/L Tris·HCl和1mmol/L EDTA，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收约120bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭AvBD2基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时，10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl、 0.1mol/L MgCl2、 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP、0.25mg/mL BSA； a、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2的双酶切鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)‑AvBD2双酶切后产生约5.4kb和120bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2；b、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2的PCR鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，4×dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（20μmol/L）各0.5μL，pcDNA3.1(+)‑AvBD2质粒1μL，ddH2O 40.5μL，ExTaq DNA聚合酶（5umol/L）0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃ 30s、56℃ 30s、72℃30s；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约120bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2；（4）鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2的制备过程：从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑AvBD2。