[发明专利]金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法

摘要

本发明公开了一种金华猪成纤维细胞系的培养方法。利用金华猪胚胎肌肉组织进行初代培养、传代培养最终获得高纯度、高活率的金华猪成纤维系，此成纤维系属于生物学领域。培养得到的成纤维细胞系不含上皮细胞等杂细胞，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，经过细胞冻存复苏后活率可达91.8~93.5%，细胞传代后生长稳定，适合大规模培养。经过细胞学特性的检测，表明该细胞系符合细胞系建系要求。本发明涉及的金华猪成纤维细胞可以用于制作转基因猪的核移植供体；可以为医学及分子生物学研究提供原材料；可以作为疫苗生产的主要原料及肝细胞培养的饲养层。农业上可以丰富和改良地方猪种，是我国地方优良猪种的有效保护手段。

主权项

一种金华猪成纤维细胞系的培养方法，其特性在于它的步骤如下：1）初代培养：快速从怀孕母猪子宫中取出40日龄的胚胎，用加双抗的PBS清洗3~4次；用眼科剪和眼科镊分离背最长肌，再用加双抗的PBS清洗3~4次，然后剪成0.5~1.0mm3的组织块；将组织块移入培养瓶并涂布均匀，倒置培养瓶，放入37~39℃，体积百分数为5%CO2的培养箱中培养3~4h；组织块完全贴壁后加入10ml的培养液，培养液成分：DMEM+10%胎牛血清继续培养8~12个小时；2）传代培养：倒出步骤1)过程中的培养液，六用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；消化后的细胞平均分成三瓶，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养至冻存前24~28h；3)细胞冻存：（1）准备冻存前24~26h弃除原有培养液并更换新的培养液10~15ml，继续培养24~26h;（2）倒出培养瓶中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；（3）用红细胞计数板计数细胞冻存前的总数；（4）1000rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，轻轻的吹打细胞使其悬浮;细胞冻存液成分：体积百分数为50%胎牛血清、体积百分数为40%DMEM及体积百分数为10%DMSO；（5）把细胞移到冻存管中，用封口膜封口；（6）将装有细胞的冻存管转移到4℃冰箱中放置1~2h，然后转入‑20℃冰箱中放置2~3h，再移入到‑70℃的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存，并做好相应的记录。