[发明专利]一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法

摘要

本发明提供了一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，属于农业生物技术领域。以单粒稻米研磨棒砸碎后，经苯酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇两步抽提后，用醋酸钾和异丙醇共同沉淀核酸；DNA沉淀经70%乙醇润洗后室温干燥，加入去离子水溶解，得到DNA粗提液；向粗提液中加入RNA核糖核酸酶A，处理后重复氯仿-异戊醇抽提、核酸沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤，获得较高质量的DNA溶液。采用本发明方法能有效的从单粒稻米胚乳中提取高质量的水稻基因组DNA，这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。

主权项

一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：1） 去除稻壳、种皮、果皮、胚的单粒稻米，经牛皮纸包裹后，用研磨棒砸碎装入1.5 mL离心管；2） 加入800 μL洗涤液于摇床上120 rpm振荡5 min去除多糖，4,000 rpm离心2 min，丢弃上清液后收集沉淀；3） 在沉淀中加入600 μL DNA提取缓冲液，漩涡振荡使沉淀悬浮并上下颠倒混匀，而后置于65°C水浴45 min以裂解细胞；4） 待上述混合物冷至室温后加入600 μL苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液，于摇床上120 rpm振荡5‑10 min至乳白色，12,000 rpm离心5 min，定量吸取500 μL上清液至另一新离心管，再加入500 μL氯仿：异戊醇体积比为24：1的氯仿‑异戊醇混合液，于摇床上120 rpm振荡5‑10 min至乳白色，12,000 rpm离心5 min后，定量吸取400 μL上清液至另一新离心管，加入40 μL pH=5.2的5 M醋酸钾溶液和293 μL异丙醇混匀，于4°C放置2 h，12,000 rpm离心10 min，丢弃上清液，收集DNA沉淀，加入1 mL 体积比为70%的乙醇后轻弹管底使沉淀悬浮，于摇床上120 rpm振荡2 min，7,000 rpm离心3 min，丢弃上清液，室温下干燥沉淀，加入100 μL去离子水溶解沉淀，获得DNA粗提液；5） 向DNA粗提液中加入核糖核酸酶A至终浓度0.1 mg/mL，37°C温浴30 min去除RNA，再加入氯仿：异戊醇体积比为24：1的氯仿‑异戊醇混合液抽提并重复上述的沉淀、润洗、干燥、溶解步骤后，将沉淀用100 μL去离子水溶解，即获得DNA溶液。