[发明专利]一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法

摘要

本发明涉及一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括材料选择、转化菌液制备、侵染方法、共培养、选择培养和GUS活性组织化学染色。利用GUS瞬时表达率的高低作为指标，来衡量一种转基因技术方法的优劣，是国际社会所公认的方法。为此，本发明采用国际社会公认的指标，对所发明的技术方法进行评价。采用本发明方法，可使甘蔗GUS瞬时表达率提高335.8-1859.3%，能有效解决利用农杆菌介导途径高效获得转基因甘蔗植株的瓶颈问题，为利用转基因技术改良甘蔗品种提供了一种外源基因导入甘蔗的关键技术方法。同时，该方法也适用于其他植物基于农杆菌介导途径的遗传转化。

主权项

一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括材料选择、转化菌液制备、侵染方法、共培养、选择培养和GUS活性组织化学染色，其特征在于：（1）材料选择：选择携带GUS(β‑glucuronidase ）基因的植物表达载体pCAMBIA2301，导入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株EHA105中，获得A菌液，A菌液为含有植物表达载体pCAMBIA2301的阳性菌液；选择的甘蔗品种为ROC22或福农95‑1702；所述导入方法，参照余云舟等在吉林农业大学学报上发表的文章《重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究》，2003,25（3）：257‑259,262；    （2）转化菌液制备：吸取100 μl  A菌液转至含有利福平35 mg/L和卡那霉素 50 mg/L浓度的50 mL LB液体培养基中，在25～28℃、120～150 r/min振荡培养至OD600=1.0～1.2，菌体于5000 rpm 离心5～10 min 后重悬于侵染液中，再次用5000rpm 离心5～10 min 后，用侵染液稀释至OD600=0.8～1.6，此菌液即为转化菌液；所述MS培养基为1962年，Murhige和Skoog公开的MS培养基；所述LB培养基为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L 氯化钠，pH7.0；所述侵染液即M1为：1/2MS＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖，pH5.8；（3）侵染方法：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，用体积比为75 %的乙醇消毒后，并将其切成不大于3 mm厚度的圆片，然后浸入步骤2的转化菌液中，放入真空干燥器中，用真空泵使内外压强差为0.05～0.08 Mpa下侵染30～50 min； （4）共培养：将步骤3侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS＋3.0 mg/L 2.4‑D＋100μmol/L 乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3d；（5）选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4‑D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+ 6.0 g/L琼脂粉，pH 5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下选择培养4d；（6）GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16h，体积比为75%酒精脱色即可；所述GUS染色液为：pH=7.0的100 mmol/L磷酸钠缓冲液、10 mmol/L EDTA ，1 mmol/L铁氰化钾 ，0.1% Triton X‑100， 2mmol/L X‑Gluc 。