[发明专利]一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法

摘要

本发明公开了一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定多酶体系；将醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶三种酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定辅酶再生体系。利用双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸，利用共固定化酶的可逆溶解特征，实现固定化酶与产物的有效分离。本发明所提供的双共固定化酶及其生产L-2-氨基丁酸的方法，具有提高固定化酶与反应物之间的可及性，提高苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和醇氧化酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶的回收利用率，提高辅酶再生效率，减少后续分离纯化步骤，简化工艺过程和降低生产成本等优点。

主权项

一种双固定化多酶体系生产L‑2‑氨基丁酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1) 苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备：(1a) 可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25℃、pH 8.0的条件下，温育0.2~6小时；(1b) 温育结束后，用0.1mol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6.0，静置2~4小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2~3次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用；(2) 醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备：(2a) 可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25℃、pH 8.0的条件下，温育0.2~6小时；(2b) 温育结束后，用0.1mol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6.0，静置2~4小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2~3次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4℃保存备用；(3) 利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶再生体系生产L‑2‑氨基丁酸：(3a) 将L‑苏氨酸和甲醇溶解于0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，用氨水调节pH值到7.0~8.0之间，L‑苏氨酸的加入量为30~200g/L，甲醇的加入量为7~50g/L；(3b) 向步骤(3a)得到的体系中加入步骤(1b)得到的共固定化多酶体系和步骤(2b)得到的共固定化辅酶再生体系，再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的加入量为0.02~0.2g/L，在20~40℃下反应6~48小时；(3c) 步骤(3b)反应结束后，用0.1mol/L的磷酸溶液调节体系的pH低于6.0，静置2~4小时，得悬浮液，离心后得到固体微球和上清液；(3d) 步骤(3c)得到的固体微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2~3次，最后加入0.05mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解固体微球，以备下次使用；(3e) 步骤(3c)得到的上清液，经浓缩结晶，烘干得到L‑2‑氨基丁酸。