[发明专利]硝基酚同分异构体污染环境的原位微生物修复方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用微生物混合菌群对硝基酚同分异构体污染环境的原位修复方法及应用。其步骤是：A、微生物混合菌群的构建:a.配制无机盐培养基：b.菌种的诱导培养c.菌体的收集；B、不同微环境模型的构建：a．土壤微环境模型的构建：b．生物反应器的制备：C、土壤样品置于30℃，生物反应器置于室温，定时取样检测污染物浓度变化。本发明可以实现40ppm硝基酚每毫克干重土壤的原位修复，以及50毫克每升生物反应器中三种硝基酚的生物修复，并且几种接入菌都可以在土壤和反应器中持续稳定的存在，证明了此种修复方法可以应用到含有硝基酚同分异构体污染的土壤、水体的环境治理中，为环境污染物的治理提供了新的思路。

主权项

一种利用微生物菌群进行混合有机污染物的生物修复的方法，其步骤是：A、微生物混合菌群的构建：a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠14.3g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸镁0.28mg，硫酸亚铁0.3mg，硫酸镁0.06mg，氯化钙1mg，硫酸铜0.05mg，硫酸锌0.05mg和硼酸0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟，在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基；b.菌种的诱导培养：在步骤a的无机盐培养基中分别补加0.5mM 2‑硝基酚，3‑硝基酚，4‑硝基酚，按2％的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strain NyZ215，Cupriavidus necator JMP134，Pseudomonas sp.strain WBC‑3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液；c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85％生理盐水清洗菌体2次；B、微环境模型的构建：a.土壤微环境模型的构建：设置了五组不同土壤处理组：A：自然土壤；B：自然土壤加三种硝基酚同分异构体；C：自然土壤加三种硝基酚同分异构体加步骤A中提到的混合菌群；D：灭菌土壤加三种硝基酚同分异构体；E：灭菌土壤加三种硝基酚同分异构体加步骤A中提到的混合菌群，每组取114.5g的天然土壤或灭菌土壤，即100g的土壤干重，3个重复，放置带有塑料旋盖的250ml玻璃瓶中，30℃孵育48h，接种量为1×108cfu/g土壤干重，按1∶1∶1的数量比例接种到相应的处理组中；b.生物反应器的制备：平均水力停留时间为3天，空气流速控制在200‑300ml min‑1，溶解氧浓度为7.8mg l‑1，诱导培养的菌株接入的量为3×107cells L‑1，将聚氨酯泡沫剪成3cm，每个聚氨酯泡沫小块的质量控制在0.5‑0.6g，利用铁丝将10个小块串成一串固定于反应器中，作为固定微生物的载体；C、硝基酚同分异构体浓度的检测：a.土壤中硝基酚同分异构体浓度的检测：微环境模型置于30℃培养，定时取样。利用高效液相色谱检测步骤B 中的a步中提到的几种处理组中的硝基酚同分异构体污染物的浓度，具体处理样品的方法为：取0.50g土壤样品加1ml的甲醇，涡旋振荡1min，200rpm振荡培养30min，12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测，具体检测条件为：C18反相色谱柱(5μm，4.6by 250mm；Agilent Technologies，流动相采用体积比60％的甲醇和40％的1％冰乙酸，流速1ml/min，检测波长为280nm，ONP、MNP、PNP的保留时间分别是17.0、12.5、11.2min；b.生物反应器中硝基酚同分异构体浓度的检测：反应器于室温开启，定时取样，具体处理样品的方式：移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测，高效液相色谱检测硝基酚同分异构体浓度与C步骤中的a步中提到的方法相同。