[发明专利]热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法

摘要

本发明提出一种热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，所述法采用先将肿瘤细胞处于热休克状态，诱导细胞高表达热休克蛋白(HSP)，再用化学药物诱导细胞凋亡进而制备成富含热休克蛋白的凋亡细胞抗原，制备好的抗原与未成熟的DC细胞混合培养获得成熟的DC疫苗。热休克脑胶质瘤细胞负载的DC疫苗具有较好的凋亡率，经流式细胞术检测，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公认标志HLA-DR+CD11c+的平均值为90.90％，DC的成熟标志CD11c+CD86+的平均值为73.03％，CD11c+CD83+的平均值为86.04％，高表达CD83、CD86。显示采用热休克法负载制备得到的DC疫苗成熟度高，可用于诱导免疫应答。

主权项

一种热休克凋亡脑胶质瘤负载树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其包括如下步骤：S1.热休克凋亡脑胶质瘤细胞的制备和检测，包括：采用的人脑胶质瘤细胞株U251引自美国ATCC，按常规方法传代培养；用RPMI1640培养基调整细胞浓度至106/ml，将细胞置于40℃，5％CO2培养箱中3h，取出细胞培养瓶，加入白桦酯酸至终浓度为10μg/ml，将细胞培养瓶移至37℃，5％CO2培养箱继续培养诱导细胞凋亡；收获凋亡细胞，加入无菌PBS洗涤4次，获得凋亡肿瘤细胞抗原；肿瘤细胞经40℃处理3h后用FITC‑Annexin‑V和PI双标细胞后进行流式检测计算凋亡率结果；软琼脂克隆法检测细胞抗原体外成瘤能力；取制备抗原进行内毒素检测；S2.DC肿瘤疫苗的制备和检测，包括：采集人体外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上运输至实验室，2,000r/min，10min，20℃获得血细胞，稀释2倍后，Ficoll分离法分离血细胞获取一次新鲜的外周血单个核细胞；用RPMI 1640培养基重悬新鲜制备的PBMC后铺于六孔细胞培养板中，放置于37℃，5％CO2培养箱中90min后，洗去未贴壁细胞，于培养板内加入含100ng/mL GM‑CSF，50ng/mL IL‑4的RPMI 1640完全培养基，第3d进行换液，第5d收获未成熟DC(imDC)，加入凋亡肿瘤细胞抗原，至37℃，5％CO2培养箱共同培育48h，收获DC细胞，苔盼蓝染色进行细胞计数与表型检测；进行流式检测HLA‑DR+CD11c+、CD11c+CD86+、CD11c+CD83+。