[发明专利]人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导方法

摘要

本发明提出一种应用含二甲基亚矾和丁化轻基苯甲醚的无血清DMEM诱导来源于人脐血间充质干细胞分化成神经元细胞。在无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的应用二甲基亚矾诱导MSCs向神经元细胞诱导分化，免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。人脐血MSCs在体外可以培养、扩增，应用二甲基亚矾诱导能向神经元样细胞分化，为中枢神经系统的损伤修复提供一种新的细胞来源。

主权项

一种人脐血间充质干细胞分化为神经元细胞的二甲基亚矾诱导方法，其包括如下步骤：S1.脐血的收集和单个核细胞的分离：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的脐带血40‑60ml，肝素抗凝，浓度为20U/ml，所有样本均于采集后12h内分离；用Hank’S平衡盐溶液1∶1稀释、混匀，叠加于Fieoll‑Hypaque上面，相对密度为1.0779/L，稀释血与Fieoll‑Hypaque液的柱高比为2∶1，以2000r/min离心20min，取界面层的单个核细胞，加Hank’S平衡盐溶液离心、洗涤两次，加入培养基中，调整细胞浓度为1x106/ml左右；S2.细胞的培养、纯化及扩增：培养基采用MesencultTM培养液，并调整其pH值使呈偏酸性，加入1％的Pen‑strep，将细胞分装于25T培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的培养箱中培养48‑72h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3‑5d半量换液一次；待细胞达到80％‑90％融合时，用1∶1的2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2∶1的比例进行传代接种培养，并记为P1代；传代培养过程中每3d半量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为几代，其余类推；S3.定向诱导MSCs：向神经元样细胞分化取传至第3代的MSCS按4x105/L密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，用含有1mmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20％FCS)预诱导24h，PBS洗涤3遍后，换成含10g/L的二甲基亚矾(DMSO)和100mmol/L的丁化轻基苯甲醚(BHA)的无血清DMEM进行诱导，每隔30min在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化；以及S4.免疫组织化学鉴定：诱导后的细胞用4％的多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3遍，加入过氧化物酶阻断液以消除内源性过氧化物酶，山羊血清工作液室温下封闭20min，去除血清后分别加入小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)单抗工作液，置于湿盒中4℃下过夜，PBS洗涤3遍，分别滴加羊抗小鼠的Ig‑FITC和TRITC的二抗工作液，37℃下孵育2h，PBS漂洗3遍，置于荧光显微镜下观察；镜下随机取10个非重叠视野(X100)，计算NSE和NF‑M阳性细胞占总细胞的比例。