[发明专利]人胚皮层神经干细胞的分离培养方法

摘要

本发明提出一种人胚皮层神经干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤：原代细胞的分离和培养；传代培养及单细胞克隆、传代；克隆诱导分化；以及间接免疫荧光检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从胚龄12周的新鲜人胚皮层中成功建立一株人胚神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。

主权项

一种人胚皮层神经干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤：S1：原代细胞的分离和培养：取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1∶1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含B27和bFGF的DMEM/F12无血清培养基，调整细胞含量为1×105ml‑1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml，37℃，5％CO2条件下静置培养7天；S2：传代培养及单细胞克隆、传代：将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含B27和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按1×104ml‑1浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO2条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7‑9天机械分离传代，方法同前；采用有限稀释法，将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40ml‑1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察；待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自某单个细胞的亚克隆；S3：克隆诱导分化：分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基(DMEM/F12/B27/bFGF+5％胎牛血清)，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测；S4：间接免疫荧光检测：将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用4％多聚甲醛固定，行Nestin抗体免疫荧光染色(抗Nestin lgG)；分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出，进行Nestin、NeuN、GFAP、CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双标染色。