[发明专利]兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用

摘要

本发明公开了兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用。目前没有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备，本发明方法通过如下步骤制备：1）α-乳清蛋白分子N端多肽抗原的合成；2）兔抗人α-乳清蛋白分子多克隆抗体的制备；3）ELISA检测抗血清效价；4）抗血清的纯化；5）α-乳清蛋白多抗的western-blot分析；6）多克隆抗体的免疫组化染色。本发明具有特异性好、纯度高的特点，可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应，可用于western-blot、免疫组化等试验的要求。

主权项

1.兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备，其特征在于如下步骤：步骤(1).经DNAStar软件分析后，将人的α-乳清蛋白N端第122141位的20个氨基酸作为兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下：TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys；步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的α-乳清蛋白多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白；步骤(3).将人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔710天；步骤(4).第三次注射1012天后，收集、分离得到含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的效价，所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体，其效价在1:60000以上；步骤(5).将步骤(2)合成并纯化后的人的α-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联，形成多肽亲和层析柱；步骤(6).将含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中，并在4℃孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体；所述的步骤(2)人的α-乳清蛋白多肽的纯化，采用HPLC，可使人的α-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上；所述的步骤(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的纯化，采用免疫亲和纯化的方式。