[发明专利]从红果小檗粗提物中筛选出的1型艾滋病病毒蛋白酶抑制剂及其应用

摘要

本发明提供一种基于荧光底物和晶体浸泡联合筛选艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的方法。采用生物活性跟踪测试在天然产物中逐级分离纯化出的一系列化合物组分对HIV‑1蛋白酶的抑制活性，最终分离纯化出成分单一组分，这单一组分就是天然产物小分子抑制剂，通过上述方法，本发明发现红果小檗的提取物能够有效抑制HIV‑1蛋白酶的活性，通过晶体浸泡的方法找到与HIV‑1蛋白酶结合能力较强的小分子，然后再通过酶活测定小分子对HIV‑1蛋白酶的抑制活性。最终，提供一种能够有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的小分子抑制剂，并且提供一种通过小分子物质与艾滋病病毒蛋白酶复合物结合筛选抗艾滋病毒物质的方法以及艾滋病病毒蛋白酶能与抑制剂相互作用的新位点以及利用该位点筛选抗艾滋病毒活性物质的方法。

主权项

一种抗艾滋病病毒物质的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1).制备艾滋病病毒蛋白酶，并结晶得到艾滋病病毒蛋白酶的晶体；(2).制备天然产物提取物，所述提取物包括通过提取、溶剂萃取或大孔树脂、硅胶等柱层析分离纯化得到的各个部位；(3).将步骤(2)得到的天然产物提取物溶于有机溶剂；使用缓冲溶液对步骤(1)中的艾滋病病毒蛋白酶溶解、稀释，然后将两种溶液混合得到混合溶液，配制荧光底物溶液，再将荧光底物溶液加入上述混合溶液中；(4).检测样品的荧光强度变化，并与不加入天然产物提取物的阴性对照品比较，得到具有抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性天然产物提取物；其中，所述艾滋病病毒蛋白酶为1型人类免疫缺陷病毒蛋白酶，制备所用HIV‑1protease质粒的氨基酸序列为PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF；采用活性追踪的方法，对确定的具有活性的天然产物提取物进一步分离纯化，对分离纯化的组分重复步骤(3)和(4)，如此多级分离、纯化和步骤(3)‑(4)的活性测定，最终得到具有活性的单体化合物，所述单体化合物为小檗碱或其药学上可接受盐；步骤(2)所述的天然产物提取物为红果小檗经过乙醇提取、乙酸乙酯萃取然后用HP‑20型大孔树脂柱层析分离，得到30％‑80％的乙醇洗脱部位。