[发明专利]一种过量表达PBD-2基因的转基因猪的培育方法

摘要

本发明公开了一种用于过量表达猪PBD-2基因的转基因猪的培育方法，其步骤：①pcDNA3.1(+)/pCA-PBD2载体构建与线性化：设计引物，提取猪的肝脏组织RNA，进行RT-PCR扩增获得PBD-2基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；②脂质体转染及细胞筛选：构建过量表达PBD-2的猪成纤维细胞；③手工克隆方法获取重组囊胚；④胚胎移植：将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中；⑤转基因猪的鉴定。方法易行，操作简便。克隆猪PBD-2基因后，将其插入到表达载体中通过细胞转染筛选出过表达猪PBD-2的猪成纤维细胞；过表达PBD-2的猪成纤维细胞进行手工核移植于猪卵母细胞而获得重构囊胚，将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，获得过表达PBD-2基因的转基因猪。具有潜在广泛抗菌能力，为抗病育种研究提供良好素材。

主权项

一种用于过量表达猪PBD‑2基因的转基因猪的培育方法，其步骤是：①pcDNA3.1(+)/pCA‑PBD2载体构建与线性化：设计一对引物，提取猪肝脏组织RNA，RT‑PCR扩增获得PBD‑2基因，通过EcoRI和XhoI将获得的片段连接到真核表达载体pCA中，获得载体pCA‑PBD2，通过SspI和XhoI双酶切pCA‑PBD2和pCDNA3.1(+)，通过连接酶连接得到pcDNA3.1(+)/pCA‑PBD2，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段，大小4189bp；②脂质体转染及细胞筛选：为了构建稳定过量表达PBD‑2的猪成纤维细胞，按照脂质体LipofectamineTM 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5％CO2，37℃培养；转染PBD‑2基因后，将核供体细胞培养2‑4天，利用600μg/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过PCR和RT‑PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到过量表达PBD‑2的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；③手工核移植方法获取重组囊胚：a.受体细胞的准备：制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38.5℃的洗卵液2％v/v血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均匀的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40‑50个为一个孔，移至在5％CO2培养箱平衡6小时，内置400μL卵母细胞体外培养液：TCM‑199(1X)80％v/v，hCG 15IU/mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0.10mg/mL，庆大霉素0.05mg/mL，猪卵泡液10％，血清10％的四孔板中，38.5℃，5％CO2成熟36小时，用于克隆操作；b.去核以及核供体细胞的注射：用5.0μg/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，将成熟后的卵母细胞‑卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，进行显微操作，将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20～25μm的尖的去核管吸取1μL细胞质，吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，产生核移植胚胎；④胚胎移植：将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植98个融合细胞，共移植4头母猪，胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测6次；⑤转基因猪的鉴定：小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，通过提取转基因猪基因组DNA进行PCR鉴定和提取转基因猪RNA进行RT‑PCR扩增相结合来对转基因阳性猪进行鉴定。