[发明专利]一种单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法

摘要

本发明为单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，主要包括以下步骤：根据选择的prfA基因和gfp基因的靶序列分别进行引物的设计；克隆载体pMD-T-△prfA-gfp的构建；重组穿梭载体pKSV7-△prfA-gfp的构建；将穿梭载体pKSV7-△prfA-gfp电转化进入LM感受态细胞；重组菌LM-△prfA-gfp的构建；经过一定条件下连续传代，获得稳定遗传的重组菌。本发明是将调控LM毒力基因表达的调控基因prfA缺失部分基因后插入gfp建立的表达GFP-ΔprfA基因重组菌，安全性高，稳定性强，免疫效果好。

主权项

一种单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失菌的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤：（一）、选择单核细胞增生性李斯特菌prfA及同源臂基因、gfp基因序列，根据选择的prfA基因和gfp基因的靶序列分别进行引物的设计,其中P1和P2引物扩增prfA及同源臂基因片段，扩增长度为1519 bp；P3和P4引物扩增gfp基因片段，扩增长度为720bp，引物序列为：P1：<210> 3 ，其酶切位点为KpnⅠ；P2：<210> 4，其酶切位点为XbaⅠ；P3：<210> 5, 其酶切位点为EcoRⅠ；P4：<210> 6，其酶切位点为BamHⅠ；（二）、克隆载体pMD‑T‑△prfA‑gfp的构建：（1）提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA；（2）扩增含有prfA基因及同源臂片段、gfp基因，提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA 2μL和pGFP‑N1质粒0.5μL作为模板；（3）克隆载体pMD19‑T‑prfA、pMD19‑T‑gfp的构建：将上述PCR产物与pMD19‑T载体连接；（4）pMD19‑T‑△prfA‑gfp载体的构建：用EcoRⅠ、BamHⅠ分别将pMD19‑T‑prfA和pMD19‑T‑gfp进行同步双酶切后将gfp连入pMD19‑T‑△prfA中；（三）、重组穿梭载体pKSV7‑△prfA‑gfp的构建:用KpnⅠ和XbaⅠ将穿梭载体pKSV7和pMD19‑T‑△prfA‑gfp进行同步双酶切后将△prfA‑gfp连入pKSV7中；（四）、将穿梭载体pKSV7‑△prfA‑gfp电转化进入LM感受态细胞：（1）LM感受态细胞的制备；（a）接种活化LM转接入5～10ml BHI培养基中过夜培养；（b）于第二日按1:50～1:100稀释转接入新鲜BHI培养基中,37℃振荡培养2.5h‑3h，至OD600为0.4‑0.5；（c）加入浓度为4～5μg/ml的Penicillin G ，继续摇至OD6000.8～1.0；（d）3.5～4.5℃, 4500～5500rpm,离心10～12min,收集细菌；（e）用预冷的10～12ml蔗糖甘油缓冲溶液吹打重悬，8000～10000rpm, 3.5～4.5℃，10～12min;（f）沉淀用体积比1/50～1/100超纯水溶解；（g）感受态每100μL ～200μL分装一管，现做现用；(2) 电转化：在2.45～2.55kv、180～220Ω和23～27μF电转参数下，用构建好的基因敲除质粒pKSV7‑△prfA‑gfp电转化感受态细菌，电转结束后将细菌涂布于含40～60μg/ml 青霉素的BHI平板，36.9～37.1℃培养46～50h，挑取所有的单菌落，用引物P1/P2进行单菌落PCR鉴定；（五）、重组菌LM‑△prfA‑gfp的构建：将含有基因敲除质粒的阳性克隆在BHI液体培养基中36.9～37.1℃培养至对数生长期，稀释后涂布于9～11μg/ml氯霉素固体培养基上，41.9～42.1℃条件下连续培养48‑72h，质粒载体与细菌DNA整合，通过温度和氯霉素抗性压力实现同源重组；从细菌菌落数最少的平板上挑取单菌落，36.9～37.1℃液体传代培养，传代时使用无抗生素BHI培养基，每传一次保一次菌，至传代30代确定质粒完全丢失后开始提取基因组DNA，用外围引物对P5：<210> 7 /P6：<210> 8进行PCR鉴定，直至出现基因组中插入gfp的重组菌；（六）、经过一定条件下连续传代，获得稳定遗传的重组菌：将上述PCR产物进行电泳，若电泳后，PCR产物出现片段大小约为2800 bp，说明样品基因组中含有gfp插入基因；如果仅出现2200 bp大小的核酸片段，则表明样品中基因组DNA中并没有插入gfp，即没有发生同源重组。