[发明专利]一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法

摘要

本发明公开了一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，包括：取甘蓝型油菜的花序作为小孢子培养的供体植株，取供体植株上的花蕾，灭菌后加入NLN-13液体培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子悬浮液；经热激处理或直接培养，得到子叶期胚状体；接种至分化培养基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性。该方法得到的小孢子质量、再生率和加倍率都得到了很大的提高。

主权项

一种利用PEG作为渗透调节剂的小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取甘蓝型油菜的花序作为小孢子培养的供体植株；(2)从所述供体植株上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN‑13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；所述的NLN‑13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2；所述含PEG6000的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L、蔗糖1～65g和62.5～250g PEG6000，pH 5.6～6.2；所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8％；所述活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；(3)将所述小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，后取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；(4)将所述子叶期胚状体接种至分化培养基中，在每天12～18小时光照和22～28℃下培养，形成再生芽；其中，所述分化培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，脱落酸2～4mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0；(5)切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照和22～28℃条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性；其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖25g，琼脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0。