[发明专利]共转染药物代谢酶和转运体的细胞模型的构建及应用

摘要

本发明提供一种共转染CYP3A4和MDR1细胞模型的构建，是先将P-gp的基因克隆到pcDNA3.1(+)上，转染MDCK细胞，经过G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-MDR1细胞株，然后将CYP3A4克隆到带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1(+)/Hygro上，转染MDCK-MDR1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共转染CYP3A4和MDR1细胞。MDCK-MDR1/CYP3A4被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCC2011119，保藏日期：2011年12月15日。本发明构建的模型，可用于模拟药物载肠道的吸收和代谢过程，进而筛选P-gp和CYP3A4共同底物。

主权项

1.一种共转染药物代谢酶CYP3A4和转运体MDR1细胞模型，通过以下构建步骤实现：（1）将MDCK细胞以10⁵／孔种于六孔板，培养48小时，用Lipofectamine^TM2000试剂将表达载体pcDNA3.1(+)／MDRl转染MDCK细胞，方法参照转染试剂说明书，转染24小时后换液，并加G418进行筛选，以浓度600ug／mL筛选96小时后升至800ug／mL筛选24小时；（2）将存活的细胞转移至培养瓶内培养，以600ug／mL的浓度培养二十天左右，按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆，通过在mRNA，蛋白等水平检测，筛选出活性较高的MDCK-MDRl细胞；（3）将MDCK-MDR1细胞以相同的密度种植于6孔板中，当细胞达50-70%汇合时进行转染，使用LipofectamineLTX转染试剂将表达载体pcDNA3.1(+)/Hygro/CYP3A4转染至MDCK-MDR1细胞，方法参照转染试剂说明书，转染6小时后换含10%FBS的DMEM培养基，培养24小时后将培养基换成400ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基；（5）隔一天换新鲜的含400ug/mL潮霉素B和10%FBS的DMEM培养基，筛选14天左右将存活的细胞按有限稀释法接种于96孔板，获得抗性单克隆MDCK-MDRl/CYP3A4细胞，由中国典型培养物保藏中心保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2011年12月15日；培养物名称：犬肾细胞MDCK-MDR1/CYP3A4，保藏编号为：CCTCCC2011119。