[发明专利]一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法

摘要

本发明涉及一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其步骤是采用离心法选出健壮的产埃博霉素B菌种接种于灭菌的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再发酵；并向发酵培养基中添加前体诱导物苯丙氨酸；在30℃培养10～11天后收获培养液；再经大孔树脂收集吸附饱和，乙酸乙酯洗脱，分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥。本发明将动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使规模化生产成为可能。通过液相制备柱可有效地提纯埃博霉素B的纯度，其纯度可达99.5％以上，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，成品能达到医药级水平。本方法大幅度提高埃博霉素B产率达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。

主权项

一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)、生产出发菌种，Soce90‑G15：通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；(2)、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；(3)、摇瓶扩培：摇瓶培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；(4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm2，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；(5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04kg/cm2，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；(6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物0.2～0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm2、培养10～11天；(7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；(8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度‑0.085～‑0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；(9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；(10)、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；(11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩，温度40～45℃、真空度‑0.085～‑0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中‑20℃低温结晶；(12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度45～50℃、真空度‑0.085～‑0.09MPa；干燥得到含量99.5％以上的活性产物埃博霉素B成品。