[发明专利]一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体及制备方法

摘要

本发明涉及一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体及制备方法，属于生物检验检疫快速领域。包括制备重组蛋白PrPres，制备抗重组蛋白PrPres单克隆抗体，本发明的单克隆抗体具有识别梅花鹿朊蛋白天然结构的能力，该单克隆抗体具有特异性强的特点，经重复试验，证明该实验结果准确，利用PrPC制备单克隆抗体主要是为获得检测朊病毒高效的免疫学检测试剂。

主权项

一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体，其特征在于是由下列方法得到的：（一）、重组朊蛋白PrPres的制备如下：（1）制备重组朊蛋白PrPres基因的人工合成引物为：       FW: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG；       RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA；（2）提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至PMD‑18T‑Simple载体上，将PrPres基因片段插入表达载体pET‑Trx中构建重组表达质粒，pET‑Trx‑ PrPres； 将PrPres基因片段插入表达载体pET‑His中构建重组表达质粒，pET‑His‑ PrPres；（3）将重组表达质粒pET‑Trx‑ PrPres和pET‑His‑ PrPres转入BL21(DE3)中进行表达，得到两种重组融合蛋白PrPres‑Trx和PrPres‑His，表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基（50mg/L抗生素），37℃剧烈摇荡培养至OD600=0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS‑PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrPres‑Trx和PrPres‑His分别以包涵体的形式大量表达；（4）切胶纯化方法，取500 μL包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样， 按常规方法进行SDS‑PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h， 将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来， 置于蒸馏水中在脱色摇床上摇 20 min， 脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后，用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS‑PAGE和Western blot鉴定后分装后放入‑80度冰箱备用；抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备：（1）动物免疫以复性的重组朊蛋白PrPres‑Trx免疫8 周龄Balb/c雌性小鼠, 100μg/只,皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂（1:1）乳化抗原, 间隔3 周后,采用弗氏不完全佐剂（1:1）乳化抗原, 进行第 2、3 次免疫，最后加强免疫时,直接用免疫原进行腹腔注射；（2）间接ELISA 筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立分别以重组成熟朊蛋白PrPres‑His和空载体菌体蛋白pET‑His包被酶标板孔,以测定PrPres‑Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定492 nm 光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为：抗原的最适合包被浓度为25μg/ml，4℃包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37℃孵育1h； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37℃孵育1h，以此建立了间接ELISA筛选方法；（3）阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测取加强免疫3d 后的小鼠脾细胞与SP2/0 细胞以5︰1 在PEG1500 的作用下融合, 以建立的间接ELISA 方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5556，分类命名：产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接ELISA 法检测连续培养30 代以及冻存5 个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；（4）单克隆抗体生物学特性的鉴定按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为 IgG2b型，以10%的梅花鹿脑匀浆包被Elisa板，以3C6纯化后单抗（1μg/ml）检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6      反应孔与阴性孔P/N在12800倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。