[发明专利]重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用。重组微纤维蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明采用大肠杆菌生产重组µPlm，通过眼部的玻璃体腔注射µPlm可以有效解除玻璃体黄斑粘连，具有特异性强、免疫原性低、副作用小等优点。利用本发明采用大肠杆菌表达系统生产的重组µPlm，制备治疗玻璃体黄斑粘连的药物，具有表达量高，生产工艺简便，生产成本低，和表达蛋白活性稳定，制品使用安全等特点。应用本发明可开发出经济安全，非手术治疗玻璃体黄斑粘连的药物，以克服目前外科切除手术所面临的费用高、手术难度大和并发症多等问题。

主权项

一种利用大肠杆菌表达系统生产重组微纤维蛋白溶酶的方法，其特征在于：包括如下合成步骤：（1）将编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于质粒的大肠杆菌E.coli表达载体pET11中，然后传导到大肠杆菌宿主BL21中，并用氨苄青霉素选择抗性克隆；所述的编码重组微纤维蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；（2）重组微纤维蛋白溶酶原多肽的表达、复性以及纯化：① 将（1）中选择的培养携带表达质粒的E.coli抗性克隆在LB/Ampicillin培养基中培养到A600=0.6‑0.9的生长期；② 加入IPTG诱导蛋白以包涵体形式表达，37 oC下继续培养3‑5小时；③ 离心收获细菌，然后通过冻融和漂洗得到纯化的包涵体；④ 在pH 8‑10的8M尿素缓冲液中溶解包涵体；所述的尿素缓冲液中含有20 mM Tris；⑤ 将含有包涵体的尿素缓冲液快速稀释到20倍的20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， pH 9.0的缓冲液中，用复性方法将变性蛋白复性成它的天然构象，得复性蛋白；⑥采用分子排阻色谱法从部分或全部未折叠的重组微纤维蛋白溶酶原多肽或它的多聚体中将复性蛋白完全分离出来，所述的分子排阻色谱法包括Superdex 200和Superdex 75，层析柱缓冲液为20 mM Tris， 0.2 M 精氨酸， 0.2 M NaCl， pH 8.0；⑦ 采用离子交换和亲和层析进一步纯化复性蛋白，即为重组微纤维蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；⑧ 分子排阻色谱法纯化的重组微纤维蛋白溶酶原多肽进一步用离子交换柱和疏水柱方法纯化；（3）将纯化的重组微纤维蛋白溶酶原多肽经活化酶激活成重组微纤维蛋白溶酶，所述的活化酶是普激酶；（4）将激活后得到的重组微纤维蛋白溶酶用离子交换柱层析法纯化，然后传入到稳定缓冲液中储存，所述的稳定缓冲液包括：20 mM 柠檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。