[发明专利]一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明涉及一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于生物检验检疫领域。免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方法：细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，为进一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA检测试剂盒奠定了基础。

主权项

一种抗卵白蛋白的单克隆抗体，其特征在于是由下列方法制成的：（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫的快速免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；（2）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，具体方法如下:强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT‑1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×108M‑1。