[发明专利]具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法

摘要

具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及一种具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。解决现有重组杆状病毒介导的基因表达效率低的问题。方法：依次构建pMD18-T-GV、pFastBac1-GV、pGM18-T-pHGV、pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]-pHBOX、pSD-CBA、pSD、pSD-L-ITR和pSD-ITRs；构建pMD18-T-EGFP；构建pSD-EGFP；构建pSD-ITRs-EGFP；转化DH10Bac细胞，获得重组载体；转染，获得重组杆状病毒。经过修饰改造的重组杆状病毒所介导的EGFP基因的表达效率明显增强。

主权项

具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行：一、PCR扩增Bacmid DNA中的gp64sp片段；二、PCR扩增pCMV‑VSVG中的VSVGED片段；三、融合PCR扩增gp64sp‑VSVGED融合片段；四、将GV片段引入pMD18‑T载体，构建质粒pMD18‑T‑GV；五、构建质粒pFastBac1‑GV；六、PCR扩增pFastBac1‑GV中的pHGV片段，将pHGV片段引入pMD18‑T载体，构建质粒pGM18‑T‑pHGV；七、PCR扩增质粒pTriEx‑2Hygro中的CBA启动子，将CBA启动子克隆至pMD18‑T载体，构建质粒pMD18‑T‑CBA；八、构建质粒载体pFastBac[pH‑]‑pHBOX；九、构建质粒载体pSD‑CBA；十、构建质粒载体pSD；十一、PCR扩增质粒pAAV‑LacZ中的L‑ITR片段和R‑ITR片段，将L‑ITR片段引入质粒载体pSD，构建质粒pSD‑L‑ITR；十二、将R‑ITR片段引入质粒pSD‑L‑ITR，构建pSD‑ITRs；十三、PCR扩增质粒pEGFP‑C3中的EGFP基因，将EGFP基因克隆至pMD18‑T载体，构建质粒pMD18‑T‑EGFP；十四、构建质粒pSD‑EGFP；十五、构建质粒pSD‑ITRs‑EGFP；十六、质粒pSD‑EGFP和质粒pSD‑ITRs‑EGFP分别转化DH10Bac细胞，获得重组载体Bacmid‑SD‑EGFP和Bacmid‑SD‑ITRs‑EGFP；十七、利用脂质体介导转染法将Bacmid‑SD‑EGFP和Bacmid‑SD‑ITRs‑EGFP转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒BV‑SD‑EGFP和BV‑SD‑ITRs‑EGFP；其中步骤一中PCR扩增引物为SD‑1和SD‑2，引物SD‑1为5′‑CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG‑3′，引物SD‑2为5′‑ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC‑3′；步骤二中PCR扩增引物为SD‑2和LM‑2，引物LM‑2为5′‑CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTCTAT‑3′；步骤三中融合PCR扩增引物为LM‑3和SD‑2，引物LM‑3为5′‑CGCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAG‑3′；步骤六中PCR扩增引物为LM‑1和LM‑2，引物LM‑1为5′‑TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG‑3′；步骤七中PCR扩增引物为SD‑3和SD‑4，引物SD‑3为5′‑GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC‑3′，引物SD‑4为5′‑GTGAATTCCGGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC‑3′；步骤十一中PCR扩增引物为LM‑11和LM‑12，引物LM‑11为5′‑TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT‑3′，引物LM‑12为5′‑TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG‑3′；步骤十三中PCR扩增引物为eGFP‑f和eGFP‑r，引物eGFP‑f为5′‑ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG‑3′，引物eGFP‑r为5′‑ TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC‑3′。