[发明专利]一种角膜板层材料的制备方法

摘要

一种角膜板层材料的制备方法，本发明是将哺乳动物眼球的角膜-巩膜复合体通过脱细胞处理、羊膜上皮干细胞培养、TSP-1诱导分泌以及脱细胞角膜基质与羊膜上皮干细胞共培养、定型与包装灭菌等步骤制备；所获得角膜板层移植材料实现了生物相容性、稳定性、透明度、力学强度、生物活性五者间的提升与平衡；最大限度地保留了角膜胶原分子和板层结构的完整，比传统方法制备的脱细胞角膜基质拉伸强度大，具有接近于正常角膜的含水率与透明度；并富集了多种细胞生长因子和TSP-1，具有特异地抗炎和抗血管化的作用，极大地增强了角膜板层材料的生物活性，可以广泛用于复杂的眼表缺损的修复，如炎症和血管化长入的角膜溃疡等。

主权项

一种角膜板层材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、脱细胞处理：将哺乳动物眼球的角膜‑巩膜复合体置于含10～50ml/L曲拉通X‑100的1mol/L氯化钠水溶液中，4℃振荡5小时；再将角膜‑巩膜复合体置于含曲拉通X‑100为2ml/L和乙二胺四乙酸钠为0.1g/L的水溶液中，4℃振荡5小时；将本步骤反复操作不少于6次，得到脱细胞角膜‑巩膜复合体；步骤二、羊膜上皮干细胞的获取：取原代羊膜上皮干细胞进行培养，当长到60％以上融合度时，用含有4g/L胰酶的PBS缓冲液消化6分钟后，将细胞悬液600g离心5分钟获取细胞，用培养液A重悬，并以1×104/cm2的密度接种原代羊膜上皮干细胞进行传代培养，得到羊膜上皮干细胞；所述培养液A的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，表皮细胞生长因子2ng/ml、人胰岛素10mg/L、牛脑垂体提取物2～20ml/L、L‑谷氨酰胺2×10‑3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和转铁蛋白100mg/L；按传代次数得到第1～5代的羊膜上皮干细胞；步骤三、诱导分泌TSP‑1以及脱细胞角膜‑巩膜复合体与羊膜上皮干细胞共培养：将第1～5代羊膜上皮干细胞以1×104/cm2的密度接种于细胞培养容器中培养，当细胞融合度长到50％以上时，更换培养液B诱导TSP‑1表达；另将脱细胞角膜‑巩膜复合体用医用酒精浸泡30分钟，并以无菌PBS缓冲液涮洗3次后置于插入式细胞培养皿中，再将该培养皿置入上述细胞培养容器中培养3天，得到含细胞生长因子和TSP‑1的脱细胞角膜基质；所述培养液B的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，肝细胞生长因子10ng/ml、 L‑谷氨酰胺2×10‑3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.6g/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml、血管紧张肽II为20～50ng/ml；步骤四、定型处理：将脱细胞角膜基质在4℃下用体积浓度40％的甘油水溶液震荡10分钟，更换体积浓度50％的甘油水溶液震荡10分钟，再更换体积浓度90％的甘油水溶液震荡30分钟，至其厚度回复到0.3～0.4mm时定型结束，得到定型的含细胞生长因子和TSP‑1的脱细胞角膜基质材料；步骤五、包装与灭菌：用生理盐水涮洗材料表面后包装，经辐照灭菌于4℃条件下保存；得到含细胞生长因子和TSP‑1的角膜板层材料。